Therapeutische veroudering via GPCR-activering in synoviale fibroblasten vergemakkelijkt de oplossing van artritis

Therapeutische veroudering via GPCR-activering in synoviale fibroblasten vergemakkelijkt de oplossing van artritis

februari 21, 2020 0 Door admin

Translating…


CBD Olie kan helpen bij artrose. Lees hoe op MHBioShop.com


Huile de CBD peut aider avec l’arthrose. Visite HuileCBD.be


 

Abstract

Rheumatoid arthritis affects individuals commonly during the most productive years of adulthood. Poor response rates and high costs associated with treatment mandate the search for new therapies. Here we show that targeting a specific G-protein coupled receptor promotes senescence in synovial fibroblasts, enabling amelioration of joint inflammation. Following activation of the melanocortin type 1 receptor (MC1), synovial fibroblasts acquire a senescence phenotype characterized by arrested proliferation, metabolic re-programming and marked gene alteration resembling the remodeling phase of wound healing, with increased matrix metalloproteinase expression and reduced collagen production. This biological response is attained by selective agonism of MC1, not shared by non-selective ligands, and dependent on downstream ERK1/2 phosphorylation. In vivo, activation of MC1 leads to anti-arthritic effects associated with induction of senescence in the synovial tissue and cartilage protection. Altogether, selective activation of MC1 is a viable strategy to induce cellular senescence, affording a distinct way to control joint inflammation and arthritis.

Introduction

From Latin senēscere—to grow old—the process of cellular senescence is a state of irreversible growth arrest which serves as a potent tumor suppressor mechanism. Although their ultimate fate is death, senescent cells remain highly metabolically active for long periods and acquire a characteristic phenotype, referred as the senescence-associated secretory phenotype (SASP) leading to context dependent outcomes1. Senescence is a strategy favored by natural selection, evidencing its positive protective value. However, senescence can also cause tissue dysfunction typical with ageing, encouraging the development of therapeutics based on senolysis or SASP reprogramming as life-extension approaches2. The existence of these two faces of senescence, one life-saving and another detrimental, is usually explained by the antagonistic pleiotropy theory, suggesting that ageing sits in the shadow of selection where harmful late-acting processes can remain in a population as long as they confer reproductive fitness early in life, as later individual performance is irrelevant for natural selection forces.

More recently, in addition to cancer and ageing, a prominent role for senescence in tissue repair has emerged, particularly when affecting fibroblasts. Expression profiling analysis revealed that senescent fibroblasts get locked in an activated state that mimics the early remodeling phase of wound healing3. Later, it has been reported that senescent fibroblasts accelerate would closure via PDGF-AA secretion4 and facilitate the reversion of fibrosis in a mouse model of liver cirrhosis5. In the human synovium, fibroblasts are key effectors of tissue destruction in rheumatoid arthritis (RA). Fibroblast main role is to provide structural support, lubrication to allow low friction movements of the articular joints and nutrients to the avascular cartilage. This benign scenario changes dramatically during RA6,7. The synovial layer transforms into a hyperplastic invasive tissue, expanding up to 10–20 cells thick in which synovial fibroblasts (SFs) acquire an aggressive proliferative phenotype turning into cytokines factories, driving cartilage and bone destruction, and promoting sustained recruitment and retention of immune cells. Thus, SFs do not merely respond to inflammatory stimuli, but become active aggressors in the RA joints.

The aggressive behavior of SFs in RA can be a consequence of failure of resolution of inflammation. While the resolution of inflammation may be perceived as a separate entity from the pro-inflammatory phase, pro-resolving mechanisms and mediators are activated in parallel to pro-inflammatory mechanisms8,9. SFs from RA patients retain their aggressive phenotype in the absence of any inflammatory stimulus7. Although SF activation lies downstream of the hierarchy of events that trigger RA, these involving predominantly immune cell infiltration, their failure to switch off after stimulation contributes to the destructive chronic inflammation typical of the RA joint6. Targeting SF may represent a promising strategy for reverting chronicity and inducing long-term remission, without inducing immunosuppression.

Melanocortin (MC) receptor agonists are promising candidates for the treatment of inflammatory conditions, including colitis10, myocardial and cerebral ischemia11,12, Alzheimer13, multiple sclerosis14, and RA15. The MC agonist adrenocorticotropin hormone (ACTH) is effective in human RA as shown over 60 years ago16. There is more recent evidence that MC therapy leads to protective actions including reduced fibroblast activation, osteoblast proliferation, and improved chondrocyte function17,18,19. In vivo, the synthetic peptide d-Trp8-γMSH reduces clinical signs of disease in experimental inflammatory arthritis20 and urate crystal peritonitis21. In addition, the pan-MC agonist AP214 and the biased AP1189 small molecule also display anti-arthritic properties15,22. In the present study, we aimed to investigate the potential therapeutic properties of MC drugs on SF from RA patients. Interestingly, we observe that selective activation of the melanocortin receptor MC1 on SF promotes cellular senescence. This receptor, with a non-redundant role in skin pigmentation, is endowed with anti-inflammatory actions23. MC1-mediated senescence leads to remarkable therapeutic consequences: cessation of SF proliferation and acquisition of a pro-repair phenotype that highly resembles that observed during senescence-driven wound healing3,4,5. This effect is achieved by activation of the receptor by a small-molecule agonist, and it is the first reported evidence of cellular senescence induced through direct activation of a G-protein coupled receptor (GPCR).

Results

The MC system is functional in SFs

We examined expression and functionality of the MC system in human primary joint SF (Supplementary Table 1). Receptors (MC1R, MC2R, MC3R, MC4R, MC5R), ligands, and precursors (POMC, ASIP, AGRP), processing enzymes (PCSK1, PCSK2), and accessory proteins (MRAP1, MRAP2) were studied. MC1R, MC3R, MC4R, and MC5R receptors were detected at the mRNA level, together with other members of the MC pathway (Fig. 1a). MC1R displayed the highest expression among the four receptors (Fig. 1b). SF could release the endogenous anti-inflammatory peptide ACTH (Fig. 1c). With respect to receptor activation, the natural pan-agonist αMSH and the MC1-selective compound BMS-470539 (BMS)24 induced ERK-phosphorylation (Fig. 1d), although they did not elevate cAMP, the canonical pathway described for this family of GPCRs25 (Fig. 1e). Both αMSH and BMS raised intracellular Ca2 (Fig. 1f). Functionally, MC receptor activation did not result in remarkable differences on early cellular responses (24–48 h) including scratch gap closure, cytokine release, SF migration or invasion (Fig. 1g–i), though some of the modest effects reached statistical significance.

Fig. 1: The Melanocortin (MC) system in synovial fibroblasts.
figure1

a Expression of several components of the MC pathway in RA SF fibroblasts as determined by end-point PCR using 1 μg of RNA (n = 4). b MCRs expression was further analyzed by real-time PCR using 1 μg of RNA. Cycle threshold (CT) values normalized against the reference control HPRT1 are shown (lower CT values denote higher expression). Numbers above bars indicate overexpression of MC1R compared to the other receptors calculated as 2−ΔΔCt. Data represent mean values, min to max range (n = 12, one-way ANOVA, Dunn’s correction; **p p = 0.001). c ACTH quantification in supernatants on SF cultured for 7 days without media replacement. Data are mean ± SD (n = 15). Dotted line represents values quantified in media without incubation with SF cells, serving as a negative control. d ERK-phosphorylation as analyzed by western blotting after 5 min stimulation of SF with MC agonists at the indicated concentrations. e Intracellular cAMP accumulation was quantified by EIA after 15 min SF cell stimulation with BMS or αMSH. The adenylyl cyclase activator forskolin (3 μM) was used as a positive control, yielding 0.58 pmol/ml. Data are mean ± SE (n = 3). f Ca2 mobilization in SF upon addition of αMSH or BMS (from 1 μM then serially diluted up to 10 pM), and recorded for 86 s. Ionomycin (1 μM) was used as a positive control, yielding 0.15 units of absorbance ratio at 340/380 nm. Data are mean ± SE (n = 3). g In vitro wound healing assay conducted using ibidi® chambers on SF cells stimulated with 10 μM αMSH and 1 μM BMS. Representative images show gap closure. Scale bars indicate 100 μm. Data are mean ± SE (n = 6, two-way ANOVA). h Cytokines release from SF stimulated with SAA at 10 μg/ml and treated with αMSH (30 μM) or BMS (10 μM) for 24 h, determined by ELISA. Data are mean ± SE (n = 15, one-way ANOVA vs. control; *p i Transwell® inserts were used for SF migration (Mig) and invasion assays on Matrigel®-coated wells (Inv). Cells were treated overnight with 10 μM BMS. Data are mean ± SE (n = 6, Student’s t-test vs. control). Source data are provided as Source Data file.

Selective MC1 activation induces senescence via ERK1/2

Both αMSH and BMS reduced 7-day cell proliferation (Fig. 2a). However, cells treated with BMS exhibited a number of specific features including expansion of the lysosomal compartment, presence of bi-nucleated cells, increase in cellular activity—Alamar blue assay—and increases in the extent of β-galactosidase-positive staining (Supplementary Fig. 1A–D). All these outcomes suggested induction of cellular senescence, a feature that was confirmed in a concentration–response assay (Fig. 2b). Interestingly, the pan-agonist αMSH, even when tested for prolonged periods up to 2 weeks, did not produce any of these changes; similar inefficacy was observed with the dual MC1/MC3 agonist, [d-Trp8]-γMSH (Supplementary Fig. 1D). The tumor suppressor protein p53 was up-regulated by BMS treatment (Fig. 2c), together with the senescence marker p16INK4, whose expression correlated with senescence-associated β-galactosidase (SA-βGal) (Fig. 2d). MC1 selective activation also induced p16INK4 expression in SF grown as 3D organoids (Fig. 2e).

Fig. 2: Cellular senescence induced by selective MC1 agonism.
figure2

a SF cells were treated for 7 days with 10 μM αMSH or 1 μM BMS and proliferation assessed by cell counting. Data are mean ± SE (n = 13, Student’s t-test vs. control; **p p b Cells were treated with BMS or αMSH for 7 days and SA-βGal cells quantified. Scale bars indicate 100 μm. Data are mean ± SE (n = 2, two-way ANOVA; **p c p53 protein levels were analyzed by western blot after 7-day treatment of SF cells with 3 or 10 μM BMS (B) or 10 μM αMSH and bands quantified (fold change with respect to vehicle). Data are mean ± SE (n = 6, Student’s t-test vs. control, C; *p d Immunofluorescence for p16INK4 in SF cells treated with 1 μM BMS was performed on SA-βGal-stained cells to determine their association. Scale bars indicate 200 μm. e SF cells were grown on Matrigel®-based 3D spheroids for 3 weeks with or without 1 μM BMS. p16INK4 was determined by immunofluorescence. Scale bars indicate 200 μm. f Effect of BMS on SA-βGal and p16INK4 staining in human macrophages incubated with 1 µM BMS for 7 days. Data are mean ± SE (n = 5, Student’s t-test vs. control, Ctrl). g Senescence on B16-F10 mouse melanocytes (1 µM BMS for 7 days) was determined by SA-βGal staining. Scale bars indicate 1000 μm. h SF were isolated from the joints of wild type (WT), Mc1re/e, or Mc3r – / – muizen en gedurende 7 dagen behandeld met 1 μM BMS (B) en / of de ERK1 / 2-remmer FR180204 (ERK−; 1 µM). Senescentie werd gekwantificeerd door SA-βGal kleuring. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 4–6, Student’s t -test versus controle, C). i Senescentie werd geïnduceerd in SF met 1 uM BMS en bepaald door SA-βGal kleuring. De MC 1 -antagonist ASIP of MC 3 / MC 4 -antagonist AGRP werden gebruikt bij 50 nM. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 3, Student’s t -test versus controle, C; ** p p i> j BMS (10 µM) werd getest op de PathHunter P-Arrestin-test. Gegevens vertegenwoordigen% activering met betrekking tot positieve controles: αMSH voor melanocortinereceptoren en ghreline voor GHS-receptor. k RT-PCR voor de referentiecontrole HPRT1 en de ghrelinereceptor GHSR op drie verschillende SF-cellijnen met verwachte banden bij 130 en 148 bp respectievelijk. Brongegevens worden geleverd als brongegevensbestand.

Om specificiteit vast te stellen, zijn experimenten uitgevoerd in andere celtypen. Inderdaad, deze pro-senescentie-effecten stroomafwaarts selectieve MC 1 activering werden niet gerepliceerd met menselijke primaire macrofagen (Fig. 2f ) of muriene melanocyten (Fig. 2g ). Op het laatste celtype was BMS een krachtige inductor van melaninesynthese (aanvullende afbeelding 1E, F ); zoals voorspeld werd dit effect niet waargenomen in SF, aangegeven door gebrek aan melanineproductie en tyrosinase-genexpressie (aanvullende figuur 1G, H ). Interessant is dat BMS ook senescentie induceerde in menselijke huidfibroblasten (aanvullende afbeelding. 1I ), wat aangeeft dat (i) dit afzonderlijke mechanisme van bredere biologische betekenis kan zijn en (ii) deze waarneming van translationele aard kan zijn waarde voor huidaandoeningen gekenmerkt door afwijkende fibroblastproliferatie en -activering.

De selectiviteit van BMS werd bevestigd in HEK293-cellen getransfecteerd met MC 1 (aanvullende afbeelding 1J ), een celtype dat is geselecteerd omdat er geen MC-receptoren zijn, dus verstoken van dit verwarrende element. BMS leverde een duidelijke concentratie-responscurve op in MC 1 -HEK293 (berekend EC 50 = 2,8 nM) waarbij de accumulatie van cAMP werd gevolgd. MC-receptor kan echter via meerdere paden signaleren 23 . BMS activeerde ERK-fosforylering in MC 1 -transfecteerde HEK293-cellen en vertoonde een gedeeltelijke agonistische activiteit op MC 3 -transfecteerde HEK293 (aanvullende afbeelding 1J a>). Aangezien SF alle MCR’s uitdrukte, met uitzondering van MC2R , werd de effectieve bijdrage van MC 1 verder onderzocht. Primaire SF van muizen met een tekort aan Mc1r of Mc3r werden getest op BMS pro-senescentie-activiteit. Dergelijke activiteit werd opgeheven door afwezigheid van functionele MC 1 maar volledig behouden in Mc3r – / – fibroblasten in de gewrichten (Fig. 2h ). Het pro-senescentie-effect van BMS in SF’s van muizen werd voorkomen door de ERK-remmer FR180204. Co-incubatie van BMS met de MC 1 natuurlijke antagonist ASIP resulteerde in verminderde SF-senescentie, een remming die niet wordt geboden door de MC 3 / MC 4 antagonist AGRP (Fig. 2i ).

Omdat GPCR’s gewoonlijk meerdere liganden binden, pasten we een β-arrestin-screening toe om mogelijke off-target effecten van BMS te volgen. Van de 168 verschillende GPCR’s die zijn getest (Fig. 2j ), BMS heeft MC 1 geactiveerd als volledige agonist terwijl gedeeltelijke activiteit werd weergegeven op andere MCR’s; een zeer zwakke activiteit (~ 30%) werd gedetecteerd voor de ghrelinereceptor (GHS-receptor). RT-PCR-analyse onthulde echter dat SF geen GHSR tot expressie brengt (Fig. 2k ). Met deze dataset kunnen we concluderen dat BMS zeer selectief is voor MC 1 en dat zijn activiteit niet ondergeschikt is aan de betrokkenheid van andere bekende GPCR’s. Gezamenlijk geven deze gegevens aan dat MC 1 -electieve activering cellulaire senescentie in primaire SF induceert via fosforylering van ERK.

MC 1 -gemedieerde senescentie leidt tot een weefselherstelprofiel

Senescentie wordt vaak geassocieerd met een specifiek secretoire fenotype genaamd SASP, dat doorgaans cytokines omvat. De SASP geïnduceerd door BMS op RA SF vertoonde dit pro-inflammatoire fenotype echter niet, omdat de niveaus van CCL-2, IL-6 of IL-8 waren verlaagd (aanvullende afbeelding 1K ). Om het fenotype dat door BMS-geïnduceerde veroudering in SF is verkregen volledig op te helderen, hebben we RNA-sequentieanalyse uitgevoerd. SF werden behandeld met BMS (met behulp van het 7-daagse incubatieprotocol) en onderworpen aan RNA-sequentiebepaling van het gehele genoom. Deze analyse identificeerde statistisch significante ( p 3a, b , aanvullende tabellen 2 en 3 ), wat een robuuste correlatie tussen RNAseq- en qPCR-gegevens aangeeft. Modulatie van verschillende genen gerelateerd aan senescentie en celcyclusregulatie werd geïdentificeerd (Fig. 3c , aanvullende afbeelding 2A ), inclusief down-regulatie van cyclinen ( CCND2 , CCNI ), opregulatie van de CDK-remmers p16 INK4 , p21 en p15 ( CDKN2A , CDKN1A , CDKN2B ), en toename van pro-overlevingssignalen die typerend zijn voor senescente cellen ( BAG1 , BCL2 ). Een basisanalyse van biofuncties (Panther-classificatiesysteem) werd uitgevoerd, waaruit een prominente rol bleek voor metabole processen en enzymatische activiteit in de door BMS gereguleerde genen (Fig. 3d ). Een eiwit-eiwit interactie (PPI) netwerk werd geconstrueerd met alle 1952 differentieel gereguleerde genen en gekoppeld aan functionele clustering met behulp van DAVID v6.8 (Fig. 3e ), waardoor een aantal zeer interactieve processen zichtbaar wordt die zijn gewijzigd door SF-behandeling met BMS. Deze omvatten celcyclusregulatie, metabole processen, lysosomale componenten en immuunsysteemreacties. De expressie van meerdere extracellulaire matrix-gerelateerde genen was ontregeld, consistent met het senescentie-geassocieerde pro-reparatie profiel zoals gerapporteerd in verschillende contexten 3 , 4 , 5 . Een nader onderzoek van deze genen onthulde een pro-remodellerend fenotype (Fig. 3f ), gekenmerkt door duidelijke down-regulatie van collagenen ( COL1A1 , COL3A1 , COL5A1 ) vergezeld door toename van metalloproteasen ( MMP3 , MMP11 ) en downregulatie van enzymen die betrokken zijn bij matrixafbraak ( ADAMTS1 , ADAMTS2 ). Aanvullende genen die relevant zijn voor het senescent fenotype dat betrokken is bij de celcyclus regulatie en lysosomale functie werden waargenomen (Fig. 3f ). De bevindingen bevestigen de senescentie-status van BMS-behandelde SF en het potentiële voordeel dat het kan hebben voor weefselherstel. We hebben ook downregulatie gevonden in meerdere genen li geëngageerd tot SF agressief fenotype, ofwel betrokken bij rekrutering van immuuncellen ( CCL2 ), retentie van T-cellen ( CXCL16 ), angiogenese ( VEGFA ), botvernietiging ( MSTN ), of cellulaire activering ( CD74 , IL18R1 ) (Fig. 3g , aanvullende afbeelding 2B ). Uit deze rijkdom aan gegevens besloten we ons te concentreren op de relatie tussen veroudering en weefselherstel.

Fig. 3: Genexpressieprofiel verkregen tijdens MC 1 -gemedieerde cellulaire senescentie.

een RNAseq-analyse op SF ( n = 8 patiëntcellijnen) behandeld met 1 μM BMS, geïdentificeerd 1952 statistisch significant ( p p waarde. Gemarkeerde genen werden gevalideerd met real-time PCR. b Negentien genen (details in aanvullende tabel 3 ) werden geselecteerd voor expressie-validatie met behulp van SYBR Green real-time PCR en vouwveranderingen berekend als 2 −ΔΔCt . Waarden verkregen door beide technieken worden tegen elkaar gepresenteerd. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 8 SF-cel, de correlatie van Pearson). c Senescentie-gerelateerde genen aanzienlijk veranderd door BMS-behandeling en hun differentiële expressiewaarde: omhoog gereguleerd in rood, omlaag gereguleerd in groen. d Functionele profilering van alle 1952 differentieel tot expressie gebrachte genen geïdentificeerd door RNAseq met behulp van Panther Classificatiesysteem. e Proteïne-eiwit interactie (PPI) netwerk gebouwd met alle 1952 aanzienlijk veranderde genen met behulp van STRING. Verdere functionele analyse werd uitgevoerd met DAVID en aanzienlijk verrijkte categorieën worden gemarkeerd. f Geselecteerde genen geassocieerd met biologische functies van interesse worden getoond met hun respectieve expressiewaarden (omhoog gereguleerd in rood, omlaag gereguleerd in groen) samen met een correlatiematrix geconstrueerd met alle genen in elke categorie. g PPI-netwerk geconstrueerd met geselecteerde genen gerelateerd aan SF-activering en agressief fenotype. De vouwveranderingen van naar beneden gereguleerde genen (in groen) geïnduceerd door BMS worden getoond. h Genen met betrekking tot veroudering en weefselherstel werden respectievelijk opgehaald uit CellAge- en TiRe-databases en een samengevoegd PPI-netwerk gegenereerd met behulp van STRING. i Connectiviteitskaartanalyse toont positieve associatie (dwz positieve score, maximale score kan 100 zijn) tussen de BMS-geïnduceerde genen geïdentificeerd door onze RNAseq-analyse en de genexpressieprofielen geïnduceerd door geneesmiddelen opgenomen in de Connectivity Map-database . Brongegevens worden geleverd als brongegevensbestand.

Query van de databases CellAge en TiRe heeft 37 en 38 genen opgehaald die zijn gewijzigd door BMS met betrekking tot senescentie en weefselherstel, respectievelijk. Het PPI-netwerk van deze genen (Fig. 3h ) suggereert dat het sterk met elkaar verband houdende processen zijn. Een Connectivity Map-analyse onthulde dat BMS-geïnduceerd transcriptioneel profiel in SF sterk lijkt op geneesmiddelen waarvan bekend is dat ze een negatieve invloed hebben op de celcyclus (Fig. 3i ). Uitgebreide informatie over alle genen gerapporteerd in Fig. 3 wordt gepresenteerd in de aanvullende tabel 3 .

Inactivering van Notch mediates Door BMS geïnduceerde senescentie

Om meer inzicht te krijgen in het mechanisme van door BMS geïnduceerde senescentie in SF, werd een pathway verrijkingsanalyse uitgevoerd met behulp van de hele dataset van differentieel tot expressie gebrachte 1952 genen. In lijn met de bovenstaande resultaten waren extracellulaire matrix en lysosoomgerelateerde paden sterk verrijkt met BMS-behandelde SF (Fig. 4a ), samen met een sterke modulatie van het lipidenmetabolisme. Het Notch-signaalpad ontstond ook, een pad dat een cruciale rol speelt tijdens de embryonale ontwikkeling en kanker 26 a> sup>. Alle genen gerelateerd aan Notch-signalering werden down-gereguleerd door BMS-behandeling, inclusief de liganden JAG1 en NOTCH3 (Fig. 4b , aanvullende tabel 3 ). We bevestigden de down-regulatie van Notch3-eiwit in SF, met verminderde niveaus van het eiwit duidelijk vanaf dag 5 na BMS-behandeling (Fig. 4c, d ). Om de causale betrokkenheid van deze route in BMS-geïnduceerde senescentie te testen, werden SF behandeld met BMS, in aanwezigheid of afwezigheid van de delta-achtige canonieke Notch ligand 4, DLL4 en senescentie gekwantificeerd door p16 INK4 kleuring. BMS heeft p16 INK4 cellen aanzienlijk verbeterd, maar dit effect werd overschreden door co-beheer van DLL4 (Fig. 4e ), wat aangeeft dat de remming van het Notch-pad minstens één is van de functionele mechanismen achter de overgevoeligheidseigenschap van BMS.

Fig. 4: Rol van het Notch-pad in SF-senescentie veroorzaakt door BMS.

a Analyse van KEGG-routes van alle 1952 differentieel tot expressie gebrachte genen na behandeling met BMS (1 µM; 7 dagen). Aantal genen geannoteerd op elke route (paars) en vouwverrijking (groen) worden weergegeven voor de top 15 routes. Het Notch-pad is gemarkeerd. b Specifieke leden van het Notch-pad omlaag gereguleerd in met BMS behandelde SF (groen); figuur is gemaakt met BioRender. Aanvullende genen worden weergegeven in de aanvullende tabel 3 . c Visuele expressie van Notch3-eiwit zoals bepaald door immunofluorescentie op SF met of zonder behandeling met BMS (1 µM; 7 dagen). Schaalbalken geven 1000 μm aan. d Kwantificering van Notch3-eiwitexpressie op SF met of zonder behandeling met BMS (1 µM gedurende 7 dagen; n = 3, eenrichtingsanova ANOVA versus controle, Ctrl; * p i> e SF’s werden gedurende 7 dagen behandeld met vehikel of 1 uM BMS, in aanwezigheid of afwezigheid van het recombinante Notch-ligand DLL4 (5 ug / ml). Senescentie werd gemeten met p16 INK4 -kleuring door immunofluorescentie en% van positieve cellen werd gekwantificeerd ( n = 3, Student’s t -test vergeleken met vehikel ( V *) of naar BMS (B # ); * p ## p

Metabole herprogrammering draagt ​​bij aan MC 1 – senescence h3>

Twee van de hierboven gepresenteerde analyses gaven aan dat veranderingen in lipidemetabolisme een prominent kenmerk zijn van MC 1 -gemedieerde veroudering. Functionele analyse van senescentie-gerelateerde genen (opgehaald uit CellAge-database) onthulde dat het metabolisme tijdens de senescentie is veranderd (Fig. 5a ). Verder verblijf in BMS-veranderde genen onthulde een duidelijke up-regulatie van de cholesterolsynthese-route, waarbij in wezen alle enzymen van acetyl-CoA tot omzetting in galzuren zijn opgereguleerd (Fig. 5b ), met afvoeren van cortisol-synthese met down-regulatie van CYP11A1 . Een PPI-netwerk gebouwd met CellAge-genen en de cholesterolroute-genen onthulde dat deze twee processen zeer interactief zijn (Fig. 5c ). Deze genomische respons werd bevestigd door verhoogde niveaus van cholesterol en extracellulaire galzuren na behandeling van SF met BMS (Fig. 5d ).

Fig. 5: Rol van cholesterol en galzuren in SF-senescentie.

a Functionele annotatie van alle 279 genen in de CellAge-database. b Cholesterol-pathway-gerelateerde genen geïdentificeerd door RNAseq van SF behandeld met 1 uM BMS gedurende 7 dagen: rood (up-gereguleerd); groen (naar beneden geregeld). Aanvullende informatie over deze genen wordt gerapporteerd in de aanvullende tabel 3 . c Proteïne-eiwit interactie (PPI) netwerk geconstrueerd met STRING onthult de interactiviteit tussen senescentie-gerelateerde genen en de cholesterolroute. d Niveaus van cholesterol en galzuren in SF behandeld met 1 uM BMS gedurende 7 dagen werden gekwantificeerd door enzymimmuunbepaling. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 11 voor cholesterol, n = 11 voor galzuren, Student’s t -test versus controle, Ctrl; * p p e SF werd behandeld met 1 uM BMS (B) met of zonder 1 uM atorvastatine (A) gedurende 7 dagen en senescentie bepaald door SA-βGal kleuring. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 3, one-way ANOVA versus controle, Ctrl; * p f Genexpressie van GPBAR1 en referentiegen HPRT1 op gedifferentieerde menselijke macrofagen op twee verschillende donoren wordt getoond met verwachte banden bij respectievelijk 63 en 130 bp . g Menselijke macrofagen werden geïncubeerd met supernatanten van senescent SF (SenS, van SF behandeld met 1 µM BMS gedurende 7 dagen), met SenS supernatants plus 5p-cholaanzuur (SenS 5p), supernatanten van controle SF (CtrlS) of direct gestimuleerd met 1 μM BMS gedurende 5 dagen. Apoptose werd beoordeeld door flowcytometrie door het meten van annexine A5 en propidiumjodidekleuring. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 3). h Geactiveerde caspase-3 werd beoordeeld door fluorescentiemicroscopie op menselijke macrofagen behandeld als in paneel g . Schaalbalken geven 200 μm aan. Brongegevens worden geleverd als brongegevensbestand.

Om te bepalen of er een functioneel verband was tussen deze metabole cascade en veroudering, werden SF behandeld met GBS met of zonder atorvastatine om de biosynthese van cholesterol te blokkeren, door remming van de 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA-reductase (HMGCR). Atorvastatine verzwakte GBS induceerde SF-senescentie met ~ 40% (Fig. 5e ). Evenzo suggereerde de toename van uitgescheiden galzuren in supernatanten een mogelijke rol van deze lipiden in de secretoomkarakteristiek van door BMS geïnduceerde senescente cellen. Als macrofagen, aanwezig in de synoviale bekleding, drukken de galzuurreceptor GPBAR1 uit (Fig. 5f ), het effect van galzuren afgescheiden door SF op de levensvatbaarheid van macrofagen werd bepaald. Menselijke primaire monocyt-gedifferentieerde macrofagen werden geïncubeerd met supernatanten van senescent SF en de GPBAR1 antagonist 5p-cholaninezuur. Incubatie van macrofagen in aanwezigheid van senescente supernatanten leverde een bescheiden toename van apoptose op (Fig. 5g ) dat werd voorkomen door de antagonist. Het effect op macrofaag apoptose door 5β-cholaninezuur werd bevestigd door gesplitste caspase-3 immunofluorescentie. Supernatanten van niet-senescente cellen of directe blootstelling van macrofagen aan BMS produceerden geen significante modulatie van apoptose (Fig. 5g, h ).

Senescence draagt ​​bij aan BMS pro-herstelacties in vivo

Om na te gaan of veroudering heeft bijgedragen aan het anti-artritische effect van BMS, hebben we een model van inflammatoire artritis gebruikt, na toediening van BMS (18 mg / kg ip per dag) na begin van artritis (dag 3) en observeren van remmende acties op klinische score en zwelling van de poot (Fig. 6a ). Positieve kleuring voor de senescentie marker p16 INK4 werd gedetecteerd in de gewrichtssynoviale voering uitsluitend bij met BMS behandelde muizen (Fig. 6b ; validatie van de p16 INK4 antilichaam wordt verstrekt in aanvullende afbeelding. 4 ​​). Om te bepalen in hoeverre de anti-artritische acties van BMS afhankelijk waren van het pro-senescentie-effect, bepaalden we het effect van senolytische geneesmiddelen, quercetine en dasatinib 27 .

Fig. 6: Anti-artritische acties van GBS worden geassocieerd met SF-senescentie.

a Artritis werd geïnduceerd in C57BL / 6NCrl-muizen met twee injecties van 100 μl KBN-serum op dag 0 en dag 2. BMS werd dagelijks intraperitoneaal toegediend in een dosis van 18 mg / kg vanaf dag 3. Klinische score en zwelling van de poten werden dagelijks geregistreerd. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 5, Student’s t -test versus controledag 9, Ctrl; * p p i> b p16 INK4 expressie werd beoordeeld door immunofluorescentie op EDTA-ontkalkte en in paraffine ingebedde kniegewrichtsecties. p16 INK4 immunokleuring wordt roze weergegeven, terwijl nucleaire kleuring met DAPI blauw is. Schaalbalken geven 100 μm aan. c Artritis werd geïnduceerd met twee injecties van 150 μl KBN-serum op dag 0 en 2. BMS werd intraperiton toegediend ally met een dagelijkse dosis van 18 mg / kg vanaf dag 3. Vanaf dag 4 werden senolytica (Sen, dasatinib quercetine in doses van respectievelijk 2,5 en 10 mg / kg) op alternatieve dagen intraperitoneaal toegediend. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 5, Student’s t -test versus controle op dag 9, Ctrl; * p d p16 INK4 expressie werd beoordeeld door immunofluorescentie op EDTA-ontkalkte en in paraffine ingebedde kniegewrichtsecties. p16 INK4 wordt in roze weergegeven. Pijlen en stippellijnen geven synoviale voering aan. e Co-lokalisatie door immunofluorescentie van senescentie marker p16 INK4 en de SF marker cadherin-11, Cad11, in knieverbindingen van artritis muizen behandeld met BMS. Schaalbalken geven 100 μm aan. f Representatieve afbeeldingen van H&E (enkelgewrichten) en Toluidine-blauwe (kniegewrichten) kleuring, met vermelding van de mate van celinfiltratie (H&E) en kraakbeenintegriteit (Toluidine-blauw) in controle en met BMS behandelde muizen. Gegevens zijn gemiddelde ± SE ( n = 5). g De mate van celinfiltratie en kraakbeenschade werden gecombineerd in een cumulatieve schadescore (max = 6). Gegevenswaarden zijn gemiddelde ± SE ( n = 5). Schaalbalken geven 2,5 mm en 500 μm aan voor H&E en 1 mm en 100 μm voor Toluidine-blauw. Brongegevens worden geleverd als brongegevensbestand.

Een co-therapieprotocol met senolytische geneesmiddelen heeft inderdaad het anti-artritische effect van BMS voorkomen met een duidelijker resultaat over de klinische score, en minder duidelijk over de modulatie van pootoedeem (Fig. 6c ). Immunofluorescentie-analyse van kniesecties onthulde efficiënte verwijdering van p16 INK4 -positieve cellen in de dieren die gelijktijdig werden behandeld met de senolytica (Fig. 6d ). Co-kleuring met p16 INK4 en de SF-marker cadherin-11 demonstreert co-lokalisatie en inductie van senescentie selectief in SF-cellen (Fig. 6e ). Knie- en enkelgewrichten werden geanalyseerd om de mate van celinfiltratie en kraakbeenintegriteit te meten (Fig. 6f, g ), wat een cumulatieve schadescore oplevert, berekend zoals weergegeven in aanvullende afbeelding 3 . BMS verminderde deze schadescore met ~ 35%, een bescherming die werd voorkomen door gelijktijdige toediening van senolytica (Fig. 6f, g ). Ten slotte bevorderde behandeling van muizen met BMS uitsluitend cellulaire senescentie bij SF, zonder waarneembare inductie van p16 INK4 waargenomen in een van de zeven andere geteste weefsels (aanvullende afbeelding 5 a >).

Associatie van MC1R genetische varianten met SF-respons op BMS

MC1R is een zeer polymorf gen met een hoge frequentie van varianten geassocieerd met functieverlies, rekening houdend met variatie in huid- en haarkleur bij de menselijke bevolking. MC1R varianten gerapporteerd in de GPCR Natural Variants Database (in totaal 83) werden geanalyseerd in SF van 20 patiënten. Acht verschillende varianten werden gedetecteerd, met allelfrequenties (q) variërend van 2,5% (bijv. V60L ) tot 10% ( V92M , D294H ) ( Fig. 7a ). Voor geen van de varianten werden homozygoten gevonden. 55% van de patiënten droeg echter ten minste één variant, wat wijst op het belang van het onderscheiden van hun impact op op MC 1 gebaseerde therapieën (Fig. 7a ). Opvallend is dat 25% van de patiënten 2 verschillende varianten kreeg, met een totaal van 10 verschillende haplotypes (Fig. 7b). Een proliferatietest en senescentie-inductie (1 uM BMS, 7 dagen) op cellen van deze 20 patiënten werd uitgevoerd. Opvallend is dat alle patiënten die niet op BMS reageerden (4 van de 20, dus 20%) de variant D294H droegen, een van de SNP’s met functieverlies die sterker geassocieerd zijn met rood haar 28 sup> (Fig. 7c ). De aanwezigheid van deze variant werd niet waargenomen in de reagerende cellen. Consistent werd een robuuste ouderdomsreactie geïnduceerd in de responders, terwijl dit effect aanzienlijk werd verzwakt in cellen die zijn geclassificeerd als non-responders en die de D294H -variant ( p = 0.0002, twee dragen) -staart Fisher’s test). Het feit dat we geen intrekking van het effect hebben waargenomen, is waarschijnlijk te wijten aan de heterozygote status en vandaar de aanwezigheid van een wildtype allel dat een deel van het effect zou kunnen aansturen. In overeenstemming met de hierboven gepresenteerde moleculaire en cellulaire mechanismen, was de productie van cholesterol ook aanzienlijk verminderd in SF op de non-respondersgroep. SA-βGale kleuring van de SF-cellen parallel aan deze resultaten (Fig. 7c ).

Fig. 7: Associatie van MC1R genvarianten met inductie van SF-senescentie.

a MC1R varianten geïdentificeerd in onze deelnemers aan de studie. Tabel bevat variantnaam, positie van nucleotide-verandering (Nt), specifieke nucleotide-verandering (SNP), variant-allelfrequentie (q), percentage (%) en aantal patiënten (nr.) En functionele uitkomst beschreven in literatuur voor elke variant ( n = 20 patiënten). De locatie van elke variant in het MC 1 -eiwit wordt in het schema getoond. b Percentage (%) en aantal (aantal) patiënten met elk van de geïdentificeerde haplotypes (totaal n = 20). c Effect van BMS op proliferatie van SF-cellijnen verkregen van elk van de 20 genotypeerde patiënten. Patiëntcellen clusteren in responders ( n = 16, groen paneel) en non-responders ( n = 4, geel paneel) volgens het effect van BMS in de proliferatietest. Voor elke groep wordt de MC1R variantanalyse getoond (A: consensus allel; a: variant allel; q: allel “a” frequentie;%: aandeel van allel “a” dragers; p: p waarde tweezijdige Fisher’s test). Bovendien, superscript R: variant met rood haar met hoge penetratie; superscript r: zwak geassocieerd met rood haar. Kwantificering en afbeeldingen van SA-βGal-kleuring worden getoond voor elke groep (schaalstrepen geven 100 μm aan) evenals cholesterolproductie gemeten met enzymimmunoassay. Gegevens zijn gemiddelde ± SE (Student’s t -test versus controle, C, * p

Deze genomische analyse onthult een potentiële therapeutische impact van varianten van het MC1R -gen zoals D294H i>. Andere veel voorkomende varianten die zwak geassocieerd zijn met het fenotype van rood haar lijken geen invloed te hebben op de cellulaire respons die BMS in SF oproept.

Discussie

We rapporteren bewijs van therapeutische inductie van cellulaire senescentie bij inflammatoire artritis door selectieve activering van een GPCR, wat het dubbele voordeel biedt van het stoppen van proliferatie van hyperproliferatieve agressieve fibroblasten samen met de inductie van een pro-reparatief fenotype. Eerdere pro-senescentie benaderingen, voornamelijk ontwikkeld als anti-kanker therapieën 29 sup>, zijn gebaseerd op het gebruik van ioniserende straling, intercalerende middelen die DNA-schade veroorzaken of kleine moleculen die rechtstreeks interfereren met celcycluscomponenten. GPCR’s 30 zijn zeer geneeskrachtige doelen, die ~ 30% van de op de markt gebrachte kleine moleculen vertegenwoordigen drugs 31 . De ontdekking van deze pro-senescentie-actie via activering van MC 1 zou een veelbelovende therapeutische weg kunnen zijn voor artritis en mogelijk andere fibroblast-gerelateerde aandoeningen.

De moleculaire mechanismen die leiden tot senescentie zijn complex en beïnvloed door specifieke micro-omgeving en cellulaire context 1 , 29 . Veroudering kan worden veroorzaakt door uitputting van replicatie wanneer een cel de Hayflick-limiet bereikt en telomeeruitval wordt waargenomen als een onherstelbare DNA-schade. A tweede type cellulaire senescentie dient als een belangrijk tumoronderdrukkingsmechanisme en is het gevolg van oncogene stress door activerende mutaties in oncogenen (bijv. BRAF ) of inactiverende mutaties in tumorsuppressorgenen (bijv. PTEN i >) Senescentie kan ook optreden door minder begrepen mechanismen, waaronder oxidatieve stress, mitotische stress of de ongevouwen eiwitrespons 2 . Het type senescentie dat we hier melden veroorzaakt door selectieve MC 1 activatie is moeilijk in te delen in eerder beschreven klassen van senescentie Na BMS-behandeling vertoonde SF verschillende kenmerken van senescentie, waaronder arrestatie van proliferatie, lysosomale expansie, SA-βGal en p16 INK4 kleuring, down-regulatie in celcycluspromotors en up-regulatie in anti- apoptotische signalen. Het is onwaarschijnlijk dat BMS replicatieve of oncogeen-gerelateerde senescentie induceerde, vanwege afwezigheid van afwijkingen zoals DNA-SCARS, dwz nucleaire foci die wijzen op DNA-schade. Het senescentieproces dat in deze studie wordt gepresenteerd, kan op andere mechanismen vertrouwen dan die eerder beschreven omdat ze worden geïnitieerd door activering van membraanreceptors. Congruent, het SASP geïnduceerd door BMS op RA SF-cellen leek niet op het typische pro-inflammatoire profiel van SASP, omdat de niveaus van CCL-2, IL-6 en IL-8 bescheiden waren naar beneden gereguleerd in plaats van naar boven gereguleerd ed. Er zijn echter aanwijzingen dat de aard van de SASP contextafhankelijk is en niet altijd wordt geassocieerd met een pro-inflammatoir profiel 32 , 33 , een idee dat consistent is met het bestaan ​​van verschillende senescentie-fenotypen hierboven besproken.

Aangemoedigd door de ontstekingsremmende eigenschappen van MC-agonisten 23 , we zijn deze studie gestart om de biologie van MC-receptoren bij SF-activering op te helderen, waarbij we eerst constateerden dat meerdere componenten van het MC-systeem tot expressie werden gebracht in SF. In receptoractivatiebepalingen vertoonde SF een bevooroordeeld activeringsprofiel in vergelijking met andere celtypen, gezien het feit dat noch de natuurlijke αMSH noch de synthetische BMS (evenals ACTH en [ d -Trp 8 sup>] – γMSH, gegevens niet getoond) bevorderde accumulatie van cAMP, de canonieke MC-signaalweg 15 maar hun toepassing leverde fosforylering van ERK1 / 2 op. Hoewel onverwacht, zijn deze resultaten consistent met een studie 34 rapportage dat αMSH cAMP-niveaus in H-211 fibroblastcellen niet verhoogt, maar juist verlaagt. Verhoging van cAMP is gerapporteerd in andere typen van fibroblasten 35 , wat contextafhankelijke resultaten en mogelijke technische verschillen suggereert. De acute (24 uur durende) ontstekingsremmende eigenschappen van alle MC-receptoragonisten die zijn getest in SF waren bescheiden, met gedeeltelijke vermindering van uitgescheiden CCL-2, CXCL-5 en IL-6 niveaus. Langdurige behandeling (7 dagen) veroorzaakte echter cellulaire senescentie. Merk op dat MC-activering niet eerder gerelateerd was aan senescentie en Mc1r e / e muizen vertonen geen enkele gevoeligheid voor kanker (anders dan door UVR geïnduceerd), veroudering of veranderde levensduur. Bovendien kan het feit dat endogene αMSH geen senescentie induceert leg uit waarom dit effect niet eerder is waargenomen. Daarom is door MC 1 geïnduceerde veroudering geen effect dat door de fysiologische acties kan worden overwogen. We veronderstellen dat selectieve activering van MC 1 sub> bevat de aanwijzing voor inductie van senescentie, wat leidt tot een functionele uitkomst die verschilt van die geproduceerd door gelijktijdige activering van m ultiple receptoren (bereikt met αMSH). Dit mechanisme kan ook de differentiële vorming van homo- of hetero-dimeren door αMSH en BMS met zich meebrengen, wat leidt tot verschillende functionele resultaten. Aangezien BMS-470539 het enige MC 1 selectieve kleine molecuul is dat ooit is gemeld, vereist volledige opheldering van dit intrigerende werkingsmechanisme de gezamenlijke inspanning van chemici en computationele biologen voor de ontwikkeling van nieuwe verbindingen. P >

Een omics-benadering werd gebruikt om het fenotype te karakteriseren verkregen door BMS-behandelde SF. Genexpressieprofielen waargenomen in met BMS behandelde cellen bevestigden het senescent fenotype, met identificatie van verschillende genen die betrokken zijn bij celcyclusstilstand, pro-survival signalen en opregulatie van lysosomale componenten, alle kenmerken van senescentie. Additionele functionele clusters waren suggestief voor fibroblast deactivering en bevordering van weefselherstel. De meest prominente verandering omvat down-regulatie van collagenen weerspiegeld door een toename van de expressie van MMP’s. Een duidelijke neerwaartse regulatie van ADAMTS-enzymen werd ook waargenomen. Deze enzymen zijn betrokken bij de afbraak van aggrecan wat leidt tot kraakbeenschade: downregulatie door BMS kan ten grondslag liggen aan verdere beschermende acties op het RA-gewricht.

Deze genanalyse onthulde belangrijke aanwijzingen voor het moleculaire mechanisme dat BMS-gemedieerd is SF senescentie. Verschillende elementen van het Notch-pad waren duidelijk naar beneden gereguleerd en verdere experimentele validatie suggereerde dat deze neerwaartse regulering geen gevolg was, maar eerder een bijdrage aan het senescentieprogramma dat werd geactiveerd door BMS. Notch-signalering speelt een cruciale rol tijdens de embryonale ontwikkeling en kanker 26 , en de remming ervan is voorgesteld als een potentiële antikankertherapie 36 , 37 In onze handen heeft activering van het pad met behulp van een recombinant ligand het pro-senescentie-effect van BMS opgeheven. Deze bevinding kan zeer relevant zijn omdat het Notch-pad kan een rol spelen in de pathogenese van RA. Activering van Notch is typerend voor RA-synoviocyten en bemiddelt hun proliferatie in reactie op TNFα 38 ; daarom is remming van Notch-signalering voorgesteld als een haalbare aanpak voor RA RA 39 . Selectieve MC 1 activatie kan dubbel voordelig zijn in RA, via de remming van Notch en daaropvolgende inductie van senescentie.

RNA-sequencing-analyse onthulde een sterke aanpassing van metabole programma’s, in het bijzonder de cholesterolroute, met al zijn componenten (biosynthetische enzymen en regulerende eiwitten) die worden gereguleerd. Cellen kunnen een verhoging van de productie van cholesterol vereisen voor verschillende doeleinden. Eén daarvan kan de productie van steroïde hormonen zijn, een route die we hebben uitgesloten omdat enzymen die verantwoordelijk zijn voor de omzetting van cholesterol in cortisol, zoals CYP17A1, CYP11B1 of HSD3B1 , werden niet gevonden tot expressie gebracht in SF (RNAseq). Noch de enzymen die leiden tot eiwitprenylatie met behulp van voorlopers geproduceerd uit de HMG-CoA-reductase route werden gemodificeerd door BMS. Cholesterol is nodig om structurele integriteit en vloeibaarheid aan celmembranen te bieden. Zijn verhoogde productie in Met BMS behandelde SF kan een uitbreiding van lys weerspiegelen osomaal compartiment, consistent met de up-regulatie van NPC1 en NPC2 betrokken bij cholesterolhandel naar lysosomen. Interactome analyse van de cholesterolroute en senescentie-gerelateerde genen onthulde dat deze twee processen sterk met elkaar verbonden zijn. Congruent had de remming van HMG-CoA-reductase met atorvastatine een significante invloed op de inductie van senescentie door BMS. De metabole herprogrammering die werd opgeroepen door selectieve MC 1 -activering eindigde in de galzuurproductie, wat suggereert dat verhoogd cholesterol ook van invloed kan zijn op het gedrag van de cel voorbij lysosomale expansie.

Aangezien SF en macrofagen de belangrijkste cel zijn soorten aanwezig in de synoviale bekleding, hebben we geëvalueerd of van SF afgeleide galzuren enig effect kunnen hebben op macrofagen, die de galzuurreceptor GPBAR1 40 sup>. We hebben vastgesteld dat galzuren die vrijkomen door SF milde effecten hadden op macrofaagapoptose, een actie die werd opgeheven door toepassing van een GPBAR1-antagonist. Deze gegevens suggereren dat BMS-geïnduceerde metabole herbedrading van SF senescentie en impact op het type secretoom dat door senescentiecellen wordt afgegeven induceert. Hoewel verdere studies nodig zijn om de rol van lipidenmetabolisme en hun regulatie van naburige synoviale macrofagen volledig op te helderen, hebben we hierin onze prioriteit gegeven aan het aanpakken van de potentiële therapeutische waarde van SF-senescentie en het bijbehorende weefselherstelprogramma in de context van gewrichtsontsteking. We hebben een muismodel van inflammatoire artritis gebruikt 41 vatbaar voor MC-agonisten 15 , 22 , 42 .

Bij artritische muizen induceerde BMS p16 INK4 expressie binnen de synoviale bekleding van artritis gewrichten, wat duidt op echte inductie van senescentie in vivo, terwijl tegelijkertijd de klinische score en gewrichtszwelling worden verminderd. MC 1 receptoractivatie kan echter leiden tot verdere ontstekingsremmende effecten via vermindering van leukocyteninfiltratie en cytokine release 24 , 43 , 44 . Daarom vonden we het belangrijk om de bijdrage van SF-senescentie aan de anti-artritische eigenschappen van GBS te evalueren en we gebruikten senolytische geneesmiddelen. Senolyse bestaat uit het selectief doden van senescente cellen door zich te richten op hun pijnlijke punt, dat wil zeggen de pro-survivalpaden die hen resistent maken tegen de vijandige omgeving die wordt geïnduceerd door hun eigen SASP 2 , 27 . Artritis muizen behandeld met een senococktail bestaande uit quercetine en dasatinib (effectief bij het elimineren van senescente cellen in vivo 27 ) onthulde eliminatie van senoviserende cellen van de synoviale voering geïnduceerd door BMS. Deze uitkomst op cellulair en weefselniveau ging parallel met preventie van de weefselbeschermende acties van BMS op gewrichtsontsteking en kraakbeenintegriteit, terwijl de senococktail minder effectief was op zwelling van de poten (een actie plausibel gekoppeld aan MC 1 modulatie van prostanoïde en cytokineproductie). p >

Het proces van veroudering is misschien niet b De intrinsiek schadelijke, maar inefficiënte verwijdering van senescente cellen uit weefsels als gevolg van verslechtering van het immuunsysteem geassocieerd met veroudering, kan een negatief resultaat opleveren 45 . Langetermijnonderzoek is nodig om te bepalen of het immuunsysteem in het kader van gewrichtsontsteking de door BMS geïnduceerde senescentcellen kan elimineren. , of als een senolytische aanpak na een pro-senescentietherapie nodig kan zijn om de therapeutische uitkomst te optimaliseren. Interessant is dat een senolytische in plaats van een pro-senescentiebenadering is getest in experimentele osteoartritis (OA) 46 . De auteurs gebruikten het elegante trimodality-reporter muismodel p16-3MR, ontworpen om de expressie van pro-apoptotische eiwitten onder de promotor van p16 te sturen INK4

gen, dat apoptose selectief induceert op senescente cellen 4 , om de bescherming van de kraakbeenintegriteit te onthullen door de eliminatie van senescente cellen. Zoals bekend zijn er fundamentele verschillen tussen RA en OA, inclusief hun relatie met veroudering Voor OA is leeftijd een van de belangrijkste risicofactoren. Senescentie in chondrocyten kan een belangrijke rol spelen bij OA-pathogenese door de integriteit van het kraakbeen te beïnvloeden, vergelijkbaar met andere senescentie-gerelateerde ziekten zoals longfibrose waarbij senescentie ook voorkomt in parenchymcellen ( alveolaire epitheelcellen) Een ander cruciaal aspect dat ten grondslag ligt aan de dubbele gunstige of nadelige uitkomst van senescentie is de inefficiënte klaring van senescente cellen als gevolg van verminderde immuunbewaking wat verantwoordelijk is voor de schadelijke effecten van de SASP 45 . In RA kan het bestaan ​​van agressieve SF in een proliferatiemodus echter een overgevoeligheidstherapie stimuleren. Het is bijna twee decennia sinds p16 INK4 activering in gewrichten werd voorgesteld als een levensvatbare anti-artritische therapie 47 . Het concept van cellulaire senescentie werd destijds echter niet diepgaand overwogen, noch de krachtige waarde van senescentie bij weefselherstel. de moeilijkheden die voortvloeien uit de adenovirale overdracht van p16 INK4 in de op dat moment voorgestelde gewrichten zouden die benadering kunnen ontmoedigen. Hier hebben we een klein molecuul geïdentificeerd, oraal biologisch beschikbaar, dat in staat is om stroomafwaartse GPCR-activering te senesceren en zonder de noodzaak van gentherapie. Het valt nog te bezien wat de consequenties en mogelijke bijwerkingen kunnen zijn van een langdurige behandeling met deze aanpak voorafgaand aan verdere therapeutische ontwikkelingen.

MC1R i> is een zeer polymorf gen, en er zijn meer dan 200 varianten beschreven 48 . Deze variatie hangt samen met de diversiteit in normale menselijke pigmentatie. MC1R varianten zijn te vinden in ongeveer 80% rood / blond haar, slecht bruinende individuen en worden sterk geassocieerd met het risico op huidkanker 28 . Verminderde MC 1 -functie leidt tot verminderde melanineproductie, waardoor de huid kwetsbaarder wordt voor UV-straling en nucleaire excisieherstel in gevaar wordt gebracht Verschillende mechanismen kunnen leiden tot MC 1 functieverlies, inclusief ontkoppeling van het G-eiwit, beperkte oppervlakte-expressie of veranderingen in de agonistische bindingsplaatsen 49 . Bijgevolg kan de hoge frequentie van deze varianten in de populatie van invloed zijn op de ontwikkeling van therapieën op basis van MC 1 .

RA-beheer kampt met een hoge economische belasting vanwege de slechte respons op huidige behandelingen (~ 40% falen) 50 , 51 . Het onvermogen om behandelingsreacties te voorspellen transformeert RA-management in trial-and-error-algoritmen. Precisiemethoden moeten worden opgenomen in het ontwikkelingsproces van geneesmiddelen. om de voordelen van de behandeling te maximaliseren: als zodanig is MC 1 een ideaal doelwit voor geneesmiddelen waarbij deze aanpak mogelijk is omdat meerdere varianten en hun functionele resultaten bekend zijn. Een groot deel (55%) van de hier bestudeerde patiëntencellen ten minste één variant droeg, en consistent met eerdere studies over vergelijkbare populaties (Brits / Iers), werden meerdere zeer penetrante varianten (R-allelen) met sterke associatie met rood haar geïdentificeerd 28 . Over het algemeen associeerden MC1R varianten niet met de effecten van BMS op SF-senescentie: de R-variant D294H werd geassocieerd met verminderde BMS-geïnduceerde veroudering. Hoewel andere R-allelen ook werden geïdentificeerd ( R151C , R160W , D84E i >), de variant D294H verschilt aanzienlijk in het mechanisme dat leidt tot functieverlies, omdat het de expressie van het celoppervlak verhoogt (in tegenstelling tot de andere varianten), mogelijk vanwege de weerstand tegen internalisatie afkomstig van defect G-eiwit koppeling en dus gebrekkige signalering 52 . Grotere studies zullen nodig zijn om een ​​sluitende associatie van D294H , en misschien andere varianten, met een verminderde MC te bieden. 1 -gemedieerd pro-senescentie-effect Het grote aantal mogelijke varianten en hun meerdere combinaties als samengestelde heterozygoot, samen met de afwezigheid van homozygoot in deze studie beperkt de mogelijkheid om een ​​regel te creëren om de respons te voorspellen. , suggereren deze eerste bevindingen een waarschijnlijke rol voor de variant D294H , aanwezig bij> 50% van de roodharige individuen 28 , over de werkzaamheid van BMS om SF-senescentie te induceren, en benadrukt meer in het algemeen het belang van het opnemen van farmacogenomica-analyse op MC 1 sub > -gebaseerde therapieën, om ervoor te zorgen dat het juiste medicijn aan de juiste patiënt wordt gegeven.

Samenvattend kan selectieve activering van de GPCR MC 1 helpen bij het herstellen van de gebroken homeostase in de RA synovium, het voorkomen van de vicieuze cirkel van wederzijdse activering tussen SF en macrofagen en andere cellen in de ontstoken gewrichtsomgeving De moleculaire signatuur van SF op MC 1 gemedieerde senescentie-inductie is consistent met een pro-reparatief profiel . We ontcijferen geleidelijk cellen en mechanismen die de resolutie bepalen en waarderen dat aanhoudende ontsteking niet alleen kan voortkomen uit verergerde pro-inflammatoire signalen, maar ook uit gebrekkige betrokkenheid van resolutieprogramma’s. Deze gegevens suggereren dat een therapeutische mogelijkheid kan ontstaan ​​door de uitbuiting van senescentie naar doelwit.SF’s die in RA niet worden uitgeschakeld.

Methoden

Primaire SF’s bij mensen

Patiënten met RA die bij dit onderzoek betrokken waren, werden gediagnosticeerd volgens de Amerikaanse 1987 Criteria van het College of Rheumatology (ACR). Deze studie voldeed aan alle relevante ethische voorschriften. De studie werd goedgekeurd door de National Research Ethics Service (NRES) Commissie West Midlands – The Black Country Ref. 07 / H1204 / 191, en alle deelnemers aan dit onderzoek gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming. Synoviaal weefsel van langdurige ziekte werd verzameld tijdens gewrichtsvervangende chirurgie. Weefsel van behandelingsnaïeve artritispatiënten werd verzameld met behulp van ultrasone geleide synoviale biopsie, waarbij weefsel werd verzameld uit meerdere regio’s in knie-, enkel- of metacarpofalangeale gewrichten waarin er aanwijzingen waren voor grijsschaalsynovitis. Ultrasone geleiding werd gebruikt om een ​​enkel portaal te introduceren waardoor weefsel werd bemonsterd met behulp van op maat gemaakte 2,0-mm snijkanten tang of een 16 g kern biopsienaald (metacarpofalangeale gewricht). Elk klinisch monster afkomstig van een patiënt gaf aanleiding tot een cellijn. Cellen werden gekweekt van zes tot acht afzonderlijke biopten om synoviale heterogeniteit te overwinnen; weefselmonsters werden in kleine secties van ongeveer 1 mm 3 gesneden met behulp van een steriel scalpel. Secties werden gesuspendeerd in 6 ml compleet fibroblastmedium en overgebracht in T25-kolven. Lijnen werden geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO en een week ongestoord gelaten. Vervolgens werd het medium wekelijks vervangen. Synoviale en huidfibroblasten werden gekweekt met compleet fibroblastmedium bestaande uit RPMI-1640, 10% niet-door warmte geïnactiveerd foetaal kalfsserum (FCS), 1% minimaal essentieel medium (MEM) niet-essentiële aminozuren, 100 mM natriumorthopyruvaat, 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine, en gebruikt tussen passages 4–8. Fibroblasten werden eenmaal per week gevoed en in cultuur gehouden tot samenvloeiing. Bij het voeden werd 66% van het kweekmedium (aangeduid als geconditioneerd medium) weggegooid en vervangen door vers compleet medium. Cellen werden geteld met behulp van een Countess TM II FL geautomatiseerde celteller (ThermoFisher Scientific).

laboratoriumdieren

Alle dierstudies werden goedgekeurd en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Ethical Committee for the Use of Animals, Barts and The London School of Medicine and Home Office-voorschriften (Guidance on the Operation of ASPA 1986) en voldeed aan alle relevante ethische voorschriften. C57BL / 6NCrl werden gekocht van Charles River. Mc1r e / e / muizen werden verkregen van The Jackson Laboratory. Mc3r – / – muizen werden oorspronkelijk verkregen van Dr. Howard Chen (Merck Laboratories). Voor alle in vivo onderzoeken werden mannelijke, leeftijd-passende wildtype (WT) muizen gebruikt.

Primaire SF’s van muizen

Hindlegs werden verkregen van mannelijke C57BL / 6NCrl, Mc1r e / e en Mc3r – / – muizen. Botten werden ontdaan van weefsel voordat botten uit elkaar werden getrokken om synoviale holten bloot te leggen. Weefsels werden enzymatisch verteerd met 2,5 mg / ml collagenase D (Roche) en 0,25 mg / ml DNase I (Sigma-Aldrich) gedurende 45 minuten, en vervolgens met 2,5 mg / ml collagenase / dispase (Roche) en 0,25 mg / ml DNase I nog 30 minuten. Cellen werden gekweekt in RPMI-1640 met 10% FCS, 2 mM 1 -glutamine, 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine. Media werden om de 3 dagen vervangen en cellen werden subgekweekt bij een samenvloeiing van 80-90%. Cellen werden gebruikt in passage 5.

Menselijke primaire macrofagen

Experimenten met gezonde vrijwilligers (schriftelijke toestemming verstrekt) werden goedgekeurd door de Queen Mary Ethics of Research Committee (QMREC2014 0,61). Bloed werd verzameld in 3,2% natriumcitraat en 1: 1 verdund in RPMI-1640 vóór scheiding door een gradiënt met dubbele dichtheid met behulp van Histopaque 1077/1119 (Sigma-Aldrich). Bloed werd gelaagd bovenop de dubbele histopake laag (H1119 onderkant, 1077 bovenkant) en gecentrifugeerd bij 1340 rpm. gedurende 30 minuten. De laag voor mononucleaire cellen (PBMC) van perifeer bloed werd verzameld en cellen werden tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). PBMC’s werden gedifferentieerd tot macrofagen in complete media (RPMI-1640, 10% FCS, 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine) in aanwezigheid van 50 ng / ml M-CSF (Peprotech) gedurende 7 dagen .

3D-minisynoviumorganoïden

Cellen werden gecentrifugeerd en pellet geresuspendeerd in Matrigel® (Corning) bij 1 x 10 6 cellen / ml . Druppeltjes (25 ul) werden uitgeplaat op met 2% poly-HEMA (Sigma-Aldrich) gecoate platen en 1 uur geïncubeerd vóór toevoeging van kweekmedia, hetzelfde als menselijke SF-kweken hierboven. Sferoïden werden 3 weken gekweekt, gefixeerd in 4% PFA en ingebed in paraffine.

Celtransfecties

HEK293T (ATCC CRL-3216) cellen werden volledig gekweekt media (DMEM, 10% FCS, 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine) en getransfecteerd met MC1R , MC3R, MC4R, MC5R , of controle TrueORF cDNA-klonen (Origene) met behulp van Lipofectamine 2000 (Invitrogen) met behulp van 2 ul Lipofectamine per 400 ng DNA in een eindvolume van 100 ul OptiMEM-media, toegevoegd aan platen met 24 putjes die 700 ul / well volledige media bevatten en 24 uur gebruikt na transfectie. Mycoplasma-besmetting werd getest met behulp van de LookOut® Mycoplasma PCR-detectiekit (Sigma).

PathHunter β-Arrestin-test

Een screeningstest op de activering van 168 GPCR was uitgevoerd met behulp van de gpcr MAX Panel-service bij Eurofins Profiling Services (Fremont, CA). Voor bepaling van de agonistactiviteit werden cellen die elk van de receptoren tot expressie brachten en die de Enzyme Fragment Complementation-technologie droegen, gedurende 90-180 minuten behandeld met 10 uM BMS en het chemoluminescentiesignaal gemeten 1 uur na toevoeging van een detectiereagenscocktail. Gegevens worden uitgedrukt als% van controleligand (αMSH voor MCR’s en ghreline voor GHS-receptor).

K / BxN-model van inflammatoire artritis

Artritis werd geïnduceerd bij mannen C57BL / 6NCrl-muizen (6 weken oud) met twee ip injecties van 100 of 150 μl K / BxN-serum op dag 0 en 2. Ziekte werd gevolgd door beoordeling van de klinische score (score per poot: 0 = geen tekenen van ontsteking, 1 = subtiele ontsteking, gelokaliseerd, 2 = gemakkelijk te identificeren ontsteking maar gelokaliseerd , 3 = duidelijke ontsteking, niet gelokaliseerd; maximale score = 12). Tekenen van milde botschade werden gedetecteerd bij sommige muizen, maar dit was niet consistent genoeg om de monitoring van de potentiële werkzaamheid van geneesmiddelen in onze experimentele instellingen mogelijk te maken. Geneesmiddelen werden i.p. op dagen 3-8 (BMS 18 mg / kg) en op dagen 4, 6 en 8 (respectievelijk dasatinib quercetine bij 2,5 en 10 mg / kg). Dit regime werd gekozen om de inductie van senescentie met BMS en de snelle eliminatie van senescente cellen met de toediening van senolytica mogelijk te maken. Doses werden gekozen volgens de toedieningsroute en het doseringsschema. Om mogelijke niet-senolytische off-target-effecten te verklaren, werd een groep muizen die alleen met senolytica werd behandeld, opgenomen. Weefsels werden 24 uur gefixeerd met 4% neutraal gebufferde formaline, 4 weken ontkalkt op 10% EDTA (voor enkels en knieën) en ingebed in paraffine.

Verbindingen

De volgende verbindingen werden gebruikt: αMSH (alfa-melanocyt stimulerend hormoon), BMS-470539 (1- [1- (3-methyl- l -histidyl- O i > -methyl- d -tyrosyl) -4-fenyl-4-piperidinyl] -1-butanon dihydrochloride) en [ d -Trp 8 ] -YMSH (Tocris); agouti signalering proteïne ASIP 87–132 en agouti-gerelateerde proteïne AGRP 83–132 (Phoenix Pharmaceuticals); serum amyloïde A (SAA; Peprotech); FR180204 (ERK1 / 2-remmer; Merck); atorvastatine, 5p-cholaanzuur, dasatinib en quercetine (Sigma-Aldrich); en DLL4 recombinant humaan eiwit (Thermo Scientific).

Enzym-gekoppelde immunosorbent assay en enzym immunoassays

De volgende kits werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant: CCL-2 en IL-6 Ready-SET-Go ELISA (eBioscience); CXCL-5 DuoSet ELISA (R&D systemen); ACTH EIA TL-kit (Phoenix Pharmaceuticals); cAMP Selecteer EIA-kit (Cayman Chemical); ERK1 / 2 (pT202 / Y204) SimpleStep ELISA Kit (Abcam); Galzuurassayset en Cholesterolkwantificatiekit (Sigma-Aldrich). De directe adenylylcyclase-activator forskolin (3 uM, TOCRIS) werd gebruikt als een positieve controle in de cAMP-test.

Cel-levensvatbaarheidstest

Cellen werden geïncubeerd met Alamar Blauw reagens (Invitrogen) verdund 1:10 in PBS gedurende 4 uur bij 37 ° C / 5% CO . Fluorescentie werd gemeten op EX560 / EM590 op een NOVOstar-lezer (BMG Labtech).

Ca 2 mobilisatiebepaling

Cellen werden geïncubeerd met 2 uM Fura-2 AM (Thermo Scientific) in HBSS zonder Ca 2 (Sigma-Aldrich) gedurende 45 minuten in het donker bij 37 ° C en gewassen met PBS. HBSS met 0,185 g / l CaCl werd vervolgens toegevoegd voorafgaand aan stimulatie met agonisten bij de aangegeven concentraties, of met 1 µM Ionomycin (SIGMA) gebruikt als een positieve controle. Mobilisatie van intracellulair Ca 2 werd gekwantificeerd door het registreren van de verhouding van fluorescentie-emissie bij 510 nm na opeenvolgende excitatie bij 340/380 nm met behulp van de NOVOstar-lezer (BMG Labtech) gedurende 86 s. Gegevens komen overeen met tijd 25 s na toevoeging van de verbinding. De gepresenteerde gegevens komen overeen met 25 seconden na toevoeging van het geneesmiddel.

iBIDI ™ scratch-test

Cellen werden gekweekt in kweekinzetstukken met twee putjes (Ibidi) in 24 putjes platen in complete media (RPMI-1640, 10% niet-door warmte geïnactiveerde FCS, 1% MEM niet-essentiële aminozuren, 100 mM natriumorthopyruvaat en 2 mM glutamine, 100 U / ml penicilline, 100 μg / ml streptomycine) tot confluent. Inserts werden verwijderd en cellen gewassen voorafgaande stimulatie met testverbindingen. Afbeeldingen werden verkregen op tijden 0, 24 en 48 uur. Kloofgrootte werd gekwantificeerd met ImageJ.

Celmigratietest

Cellen werden gezaaid in SF-medium, zoals hierboven, maar zonder serum op Transwell-inserts (diameter 6,5 mm, Poriëngrootte van 8 μm; Corning) gecoat met Matrigel® Basement-membraanmatrix (Corning) voor invasie-assays en niet-gecoat voor migratie-assays. Tien procent FCS-media werd toegevoegd aan het buitenste compartiment. Cellen werden overnacht geïncubeerd, gekleurd met 1% kristalviolet (Sigma-Aldrich) en geteld.

Apoptosis-test

Cellen werden gekleurd met FITC-AnxAV en propidium jodide (PI) met behulp van de Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen), door monsters te kleuren met 5 μl Annexine A5 en 10 μl PI gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en geanalyseerd met flowcytometrie (BD FACSCalibur ™).

Western-blotanalyse

Cellen werden gelyseerd met behulp van RIPA-buffer (Thermo Scientific) die proteaseremmerscocktail bevat bij 1: 100 verdunning (Calbiochem). Monsters werden onderworpen aan standaard SDS-PAGE en overgebracht op PVDF-membranen (Merck Millipore). Gebruikte antilichamen en verdunningen waren: anti-fosfo-ERK1 / 2 (1: 1000; Celsignalering), anti-ERK1 / 2 (1: 1000; Celsignalering), anti-α-tubuline (1: 5000; Sigma-Aldrich) , konijn anti-p53 (1: 2000; Abcam), HRP-geconjugeerd anti-konijn en anti-muis IgG (1: 2000; Dako). Banden werden gekwantificeerd met behulp van ImageJ.

Immunofluorescentieanalyses

Cellen werden gefixeerd met 4% PFA en gepermeabiliseerd met 0,3% Triton X-100. Voor muizenweefsels werd antigeen ophalen uitgevoerd door dia’s in basische buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) gedurende 5 minuten bij 95 ° C te incuberen. Monsters werden overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen: anti-mens / muis p16 INK4a (1: 100; Abcam), anti-muis p16 INK4 (onverdund; CNIO, kloon PABLO33B) , anti-cadherin-11 (1:10; Celsignalering), anti-gesplitst caspase-3 (1: 100; Celsignalering), anti-Notch3 (1: 200; Abcam). Secundaire antilichamen (1: 100; Thermo Scientific) werden 2 uur geïncubeerd: anti-muis en anti-konijn IgG Alexa Fluor 594, anti-konijn IgG Alexa Fluor 647, anti-rat IgG Alexa Fluor 647. Dia’s waren dekglaasje met ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI (Thermo Scientific) en afbeeldingen verkregen bij een vergroting van × 20 op het EVOS FL Imaging System (Thermo Scientific). Belichting en scherpte werden constant gehouden voor alle foto’s ter vergelijking.

Cel- en weefselkleuring

De volgende kits (Abcam) werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant: Senescence Detectiekit (SA-βGal) en Fontana-Masson (melanine). H&E kleuring werd uitgevoerd op gedeparaffineerde en gerehydrateerde secties met behulp van hematoxyline en eosine (Sigma-Aldrich) en gemonteerd in Entellan-montagemedium. Celinfiltratie werd gescoord als: 0 = niet gedetecteerd, 1 = mild, 2 = matig, 3 = ernstig. Kraakbeenkleuring werd uitgevoerd met toluidineblauw (1%, 10 min) (Sigma-Aldrich). Kraakbeenintegriteit (verlies van gesulfateerde proteoglycanenkleuring) werd beoordeeld als: 0 = normaal, 1 = mild verlies, 2 = matig verlies, 3 = totaal verlies van kleuring. Afbeeldingen werden verkregen bij een vergroting van × 20 op een Nanozoomer S210 Slide Scanner (Hamamatsu). Belichting en scherpte werden in alle beelden constant gehouden ter vergelijking.

Melaninemeting

B16-F10-cellen werden gekweekt in 10% FCS aMEM. Cellen werden 4 dagen behandeld en gekleurd met Fontana-Masson-kleuring of gecentrifugeerd om melanine in celpellets zichtbaar te maken. Melaninegehalte in supernatanten werd bepaald door het meten van de absorptie bij 405 nm.

Genexpressieanalyses

RNA werd geëxtraheerd met Direct-zol RNA MiniPrep met in-kolom DNase I spijsvertering (Zymo Research). cDNA werd gesynthetiseerd (1 pg RNA) met SuperScript VILO MasterMix (Invitrogen). Eindpunt-PCR werd uitgevoerd met ReddyMix PCR MasterMix (Thermo Scientific). Realtime-PCR werd uitgevoerd met Power SYBR Green PCR MasterMix (Applied Biosystems) op het ABI Prism 7900HT-sequentiedetectiesysteem. Expressie werd berekend als 2 −ΔΔCt 53 HPRT gebruiken als referentiegen 54 . Gebruikte Quantitect-primers (QIAGEN) worden weergegeven in tabel S2 , met een gloeitemperatuur van 55 ° C die voor alle primers wordt gebruikt. RNA-sequentiebepaling werd uitgevoerd bij Eurofins-GATC-services (Konstanz, Duitsland) met behulp van niet-gestrand willekeurig geprimed cDNA op een Illumina HiSeq Genome Sequencer, sequentiemodus HSHOv4 SR50 (HiSeq snelle run, 50 bp enkele lees). Reeksen sequenties werden uitgelijnd met het humaan genoom build hg38 / GRCh38 met de HISAT2-aligner. Transcriptkwantificering werd uitgevoerd met htseq-telling (HTSeq-pakket v0.6.1p1), met behulp van GENCODE v23-annotatie van menselijk gen (Ensembl-release 81). De gelezen telgegevens werden gefilterd om genen te behouden die ten minste één leestelling per miljoen (cpm) bereiken in ten minste vier monsters. Daarom moet, om tot expressie te worden gebracht, elk gegeven gen een waarde van ten minste cmp = 1 bereiken in ten minste de 25% van de monsters (d.w.z. 4 monsters). Leestwaarden per kilobase per miljoen in kaart gebrachte leeswaarden (RPKM) werden berekend met de voorwaardelijke kwantielnormalisatie (cqn) geteld voor genlengte en GC-gehalte in de statistische R-omgeving via bioconductor. Genen met p > 0,05 werden opgenomen, wat een werklijst opleverde van 1952 differentieel tot expressie gebrachte genen. Dit onderzoek maakte gebruik van Apocrita HPC-faciliteit ondersteund door QMUL research-IT. Gegevens werden gedeponeerd in GEO: toegangscode GSE98658.

Functionele analyse en databases

De functionele analyse van de eerder geïdentificeerde differentieel tot expressie gebrachte genen (1952) werd uitgevoerd met DAVID v6.8 en Panther Classificatiesysteem v12.0 door de volledige set genen te uploaden. Het genexpressieprofiel geïnduceerd door BMS werd gebruikt om de Connectivity Map v02 perturbation-driven genexpressiegegevensset op te vragen met behulp van standaardinstellingen. PPI-netwerken werden geconstrueerd met behulp van STRING v10.5 door de volledige genenlijst te uploaden en niet-verbonden knooppunten van het resulterende netwerk uit te sluiten. We hebben ook informatie uit de volgende databases gebruikt: CellAge Database v beta , TiRe Database 1.0 en GPCR NaVa Database.

MC1R-gensequencing

Het gehele coderingsgebied van MC1R werd geamplificeerd met behulp van de primers Forward: 5′-GAAGAACTGTGGGGACCTGG-3 ‘en Reverse: 5′-GGGTCACACAGGAACCAGAC-3’. PCR-producten werden gezuiverd met QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) en sub uitgevoerd op Sanger-sequencing bij Eurofins-GATC-services (Konstanz, Duitsland) met behulp van een ABI 3730xl DNA Analyzer en basecaller KB v1.4.1.8. Elektroferogrammen werden geanalyseerd met * .ab1-bestanden en varianten gedetecteerd met SnapGene® Viewer v3.0.3 en de Homo sapiens MC1R referentiereeks NM_002386.3.

Statistische analyse

In elk experiment dat in deze studie is opgenomen, wordt de waarde van n altijd gedefinieerd als het aantal biologische replica’s (bijvoorbeeld deelnemers, muizen) en niet technische replica’s. Statistische parameters inclusief de exacte n waarde voor elk experiment, de aard van de getoonde gegevens (gemiddelde ± SE of gemiddelde ± SD) en statistische significantie worden gerapporteerd in de figuurlegendes. Gegevens worden als statistisch significant beschouwd wanneer p t -test, eenrichtings-ANOVA of tweeweg-ANOVA werden waar nodig gebruikt. In de figuren duiden sterretjes of hashes statistische significantie aan (* , # p , ## p i> p

Samenvatting van de rapportage

Meer informatie over onderzoeksontwerp is beschikbaar in de Natuuronderzoekrapportage Samenvatting a> gekoppeld aan dit artikel.

                                                 

Beschikbaarheid van gegevens

Alle gegevens ter ondersteuning van de hierin gepresenteerde resultaten zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de desbetreffende auteurs. Ruwe gegevensbestanden voor de RNA-sequentieanalyse zijn gedeponeerd in de NCBI Gene Expression Omnibus onder toegangsnummer GEO: GSE98658. De onderliggende gegevens van grafieken en niet-bijgesneden gels en blots in de hoofdfiguren en aanvullende informatie worden geleverd als brongegevensbestand.

Verwijzingen

  1. 1.

    Rodier, F. & Campisi, J. Vier gezichten van cellulaire senescentie. J. Cell Biol. 192 , 547–556 (2011).

  2. 2.

    Childs, BG et al. Verouderde cellen: een opkomend doelwit voor ouderdomsziekten. Nat. Rev. Drug Discov. 16 , 718–735 (2017).

  3. 3.

    Shelton, DN, Chang, E., Whittier, PS, Choi, D. & Funk, WD Microarray-analyse van replicatieve veroudering. Curr. Biol. 9 , 939–945 (1999).

  4. 4.

    Demaria, M. et al. Een essentiële rol voor senescente cellen bij optimale wondgenezing door secretie van PDGF-AA. Dev. Cell 31 , 722–733 (2014).

  5. 5.

    Krizhanovsky, V. et al. Senescentie van geactiveerde stellaire cellen beperkt leverfibrose. Cel 134 , 657–667 (2008).

  6. 6.

    Buckley, C. D. et al. Fibroblasten reguleren de omschakeling van acuut oplossen naar chronische aanhoudende ontsteking. Trends Immunol. 22 , 199–204 (2001).

  7. meta > Bottini, N. & Firestein, GS Dualiteit van fibroblast-achtige synoviocyten in RA: passieve responders en ingeprinte agressors. Nat. Rev. Rheumatol. 9 , 24–33 (2013).
  8. meta > 8.

    Perretti, M., Leroy, X., Bland, EJ & Montero-Melendez, T. Resolutie farmacologie: mogelijkheden voor therapeutische innovatie bij ontstekingen. Trends Pharmacol. Sci. 36 , 737–755 (2015).

  9. 9. Serhan, CN & Savill, J. Resolutie van ontsteking: het begin programmeert het einde. Nat. Immunol. 6 , 1191–1197 (2005).
  10. 10.

    Bettenworth, D. et al. De tripeptide KdPT beschermt tegen darmontsteking en behoudt de darmbarrièrefunctie. Am. J. Pathol. 179 , 1230–1242 (2011).

  11. 11.

    Ottani, A. et al. NDP-alpha-MSH vermindert hart- en leverreacties op myocardiale reperfusie via de nervus vagus en JAK / ERK / STAT-signalering. Eur. J. Pharmacol. 769 , 22–32 (2015).

  12. 12.

    Holloway, PM et al. Zowel MC1- als MC3-receptoren bieden bescherming tegen rekrutering door cerebrale ischemie-reperfusie. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 35 , 1936–1944 (2015).

  13. 13.

    Giuliani , D. et al. NDP-alfa-MSH induceert intense neurogenese en cognitief herstel bij transgene muizen van Alzheimer door activering van melanocortine MC4-receptoren. Mol. Cell Neurosci. 67 , 13–21 (2015).

  14. 14.

    Mykicki, N. et al. Melanocortine-1-receptoractivering is neuroprotectief in muismodellen van neuro-inflammatoire aandoeningen. Sci. Vert. Med i>. 8 , 362ra146 (2016).

  15. 15.

    Montero-Melendez, T., Gobbetti, T., Cooray, SN, Jonassen, TE & Perretti, M. Biated agonism als een nieuwe strategie om te benutten de vooroplossende eigenschappen van melanocortinereceptoren zonder melanogene effecten op te wekken. J. Immunol. 194 , 3381–3388 (2015).

  16. 16.

    Gutman, A. B. & Yu, T. F. Effecten van adrenocorticotroop hormoon (ACTH) bij jicht. Am. J. Med. 9 , 24–30 (1950).

  17. 17.

    Grassel, S. et al. Het melanocortinesysteem in articulaire chondrocyten: melanocortinereceptoren, pro-opiomelanocortine, precursorproteasen en een regulerend effect van alfa-melanocyten-stimulerend hormoon op pro-inflammatoire cytokines en extracellulaire matrixcomponenten. Artritis Reumat. 60 , 3017–3027 (2009).

  18. 18.

    Dumont, LM, Wu, CS, Tatnell, MA, Cornish, J. & Mountjoy, KG Bewijs voor directe acties van melanocortin peptiden op botmetabolisme. Peptiden 26 , 1929–1935 (2005).

  19. 19.

    Bohm, M. & Luger, TA Melanocortins in fibroblastbiologie – huidige update en toekomstperspectief voor dermatologie. Exp. Dermatol. 13 (Suppl 4), 16–21 (2004).

  20. 20.

    Patel, HB et al. Ontstekingsremmende en antiosteoclastogenese-eigenschappen van endogene melanocortinereceptor type 3 bij experimentele artritis. FASEB J. 24 , 4835–4843 (2010).

  21. 21.

    Getting, SJ, Lam, CW, Chen, AS, Grieco, P. & Perretti, M. Melanocortin 3 receptoren controle kristal-geïnduceerde ontsteking. FASEB J. 20 , 2234-2241 (2006).

  22. 22.

    Montero-Melendez, T. et al. De melanocortine-agonist AP214 heeft ontstekingsremmende en voorloper-eigenschappen. Am. J. Pathol. 179 , 259–269 (2011).

  23. 23.

    Montero-Melendez, T. A. C. T. H. De vergeten therapie. Semin. Immunol. 27 , 216–226 (2015).

  24. 24.

    Herpin, TF et al. Ontdekking van op tyrosine gebaseerde krachtige en selectieve melanocortin-1-receptor kleinmoleculaire agonisten met ontstekingsremmende eigenschappen. J. Med. Chem. 46 , 1123-1126 (2003).

  25. 25 .

    Mountjoy, KG, Robbins, LS, Mortrud, MT & Cone, RD Het klonen van een familie van genen die coderen voor de melanocortin-receptoren. Wetenschap 257 , 1248–1251 (1992).

  26. 26.

    Giaimo, BD & Borggrefe, T. Inleiding tot moleculaire mechanismen in Notch-signaaltransductie en ziektepathogenese. Adv. Exp. Med. Biol. 1066 , 3–30 (2018).

  27. 27.

    Zhu, Y. et al. De achilleshiel van senescente cellen: van transcriptoom tot senolytische medicijnen. Aging Cell 14 , 644–658 (2015).

  28. 28.

    Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, JL & Thody, AJ Varianten van het melanocyt-stimulerende hormoonreceptorgen worden geassocieerd met rood haar en een lichte huid bij de mens. Nat. Genet. 11 , 328–330 (1995).

  29. 29.

    Nardella, C., Clohessy, JG, Alimonti, A. & Pandolfi, PP Pro-senescentietherapie voor behandeling van kanker. Nat. Rev. Cancer 11 , 503-511 (2011).

  30. meta> 30.

    Kroeze, WK, Sheffler, DJ & Roth, BL G-eiwit-gekoppelde receptoren in één oogopslag. J. Cell Sci. 116 , 4867–4869 (2003).

  31. 31.

    Hopkins, A. L. & Groom, C. R. Het medicijnbare genoom. Nat. Rev. Drug Discov. 1 , 727-730 (2002).

  32. 32.

    Coppe, JP et al. Tumorsuppressor en verouderende biomarker p16 (INK4a) induceert cellulaire senescentie zonder het bijbehorende inflammatoire secretoire fenotype. J. Biol. Chem. 286 , 36396–36403 (2011).

  33. 33.

    Maciel- Baron, LA et al. Senescentie geassocieerd secretorisch fenotype profiel van primaire longmuizen fibroblasten hangt af van de senescentie inductie stimuli. Leeftijd (Dordr.) 38 , 26 (2016).

  34. 34.

    Stanisz, H., Seifert, M., Tilgen, W., Vogt, T. & Rass, K. Wederzijdse responsen van fibroblasten en melanocyten op alfa-MSH afhankelijk van MC1R-polymorfismen. Dermatoendocrinology 3 , 259-265 (2011).

  35. 35.

    Bohm, M. et al. alpha-MSH moduleert celadhesie en ontstekingsreacties van synoviale fibroblasten van artrosepatiënten. Biochem. Pharm. 116 , 89–99 (2016).

  36. 36.

    Kaemmerer, E., Jeon, MK, Berndt, A., Liedtke, C. & Gassler, N. Targeting Wnt signalering via Notch in darmcarcinogenese. Kanker (Bazel) 11 , https://doi.org/10.3390/cancers11040555 (2019).

  37. 37.

    Ceccarelli, S. et al. Targeting Notch3: een nieuw wapen tegen stamcellen van eierstokkanker. Stamcellen Int. . 2019 , 6264931 (2019).

  38. 38.

    Ando, ​​K. et al. Inductie van Notch-signalering door tumornecrosefactor in reumatoïde synoviale fibroblasten. Oncogene 22 , 7796–7803 (2003).

  39. 39.

    Park, J. S. et al. Remming van Notch-signalering verbetert experimentele ontstekingsartritis. Ann. Rheum. Dis. 74 , 267–274 (2015).

  40. 40.

    Martinot, E. et al. Galzuren en hun receptoren. Mol. Asp. Med 56 , 2–9 (2017).

  41. 41.

    Ditzel, H. J. De K / BxN-muis: een model van inflammatoire artritis bij de mens. Trends Mol. Med. 10 , 40–45 (2004).

  42. 42.

    Montero- Melendez, T. et al. Verband tussen parodontitis en inflammatoire artritis onthult modulerende functies door melanocortinereceptor type 3. Am. J. Pathol. 184 , 2333-2341 (2014).

  43. 43.

    Leoni, G. et al. De melanocortine MC (1) receptoragonist BMS-470539 remt de handel in leukocyten in het ontstoken vaatstelsel. Br. J. Pharm. 160 , 171–180 (2010).

  44. 44.

    Kang, L. et al. Een selectieve agonist van de kleine molecule van de melanocortine-1-receptor remt door lipopolysaccharide geïnduceerde cytokine-accumulatie en leukocyteninfiltratie bij muizen. J. Leukoc. Biol. 80 , 897–904 (2006).

  45. 45.

    Ovadya , Y. et al. Verminderde immuunbewaking versnelt de accumulatie van senescente cellen en veroudering. Nat. Commun. 9 , 5435 (2018).

  46. 46.

    Jeon, OH et al . Lokale klaring van senescente cellen vermindert de ontwikkeling van posttraumatische artrose en creëert een pro-regeneratieve omgeving. Nat. Med. 23 , 775–781 (2017).

  47. 47.

    Taniguchi , K. et al. Inductie van het p16INK4a senescentie-gen als een nieuwe therapeutische strategie voor de behandeling van reumatoïde artritis. Nat. Med. 5 , 760–767 (1999).

  48. 48.

    Tagliabue, E. et al . Associatie van melanocortine-1-receptor-varianten met pigmenteigenschappen bij mensen: een gepoolde analyse van het M-Skip-project. J. Invest Dermatol 136 , 1914–1917 (2016).

  49. 49.

    Garcia-Borron, JC, Sanchez-Laorden, BL & Jimenez-Cervantes, C. Melanocortin-1-receptorstructuur en functionele regulatie. Pigment Cell Res. 18 , 393–410 (2005).

  50. meta> 50.

    McInnes, IB & Schett, G. Pathogenetische inzichten bij de behandeling van reumatoïde artritis. Lancet 389 , 2328-2337 (2017).

  51. 51.

    Smolen, J. S., Aletaha, D. & McInnes, I. B. Reumatoïde artritis. Lancet 388 , 2023–2038 (2016).

  52. 52.

    Sanchez-Laorden, BL et al. Afwijkende handel in menselijke melanocortine 1-receptor-varianten geassocieerd met rood haar en huidkanker: steady-state retentie van mutante vormen in de proximale Golgi. J. Cell Physiol. 220 , 640–654 (2009).

  53. 53.

    Livak, KJ & Schmittgen, TD Analyse van relatieve genexpressiegegevens met behulp van real-time kwantitatieve PCR en de 2 −ΔΔCt methode. Methoden 25 , 402–408 (2001).

  54. meta > 54. Montero-Melendez, T. & Perretti, M. Gapdh-genexpressie wordt gemoduleerd door inflammatoire artritis en is niet geschikt voor qPCR-normalisatie. Ontsteking 37 , 1059-1069 (2014).

Referenties downloaden

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door Medical Research Council (subsidie ​​MR / K013068 / 1) en William Harvey Research Foundation. T.M.-M. werd ondersteund door Medical Research Council (subsidie ​​MR / K013068 / 1) en Versus Arthritis UK (subsidie ​​21274). Het werk van de auteurs C.D.B. en A.F. wordt ondersteund door NIHR Oxford en Birmingham Biomedical Research Centres. De standpunten zijn die van de auteurs en niet noodzakelijk die van de NHS, het NIHR of het ministerie van Volksgezondheid en Sociale Zorg. Wij danken J.D. Turner voor technische assistentie. We danken Dr. M. Serrano, K. Meyer, M. Garcia (Instituut voor Onderzoek in Biomedicine, Spanje), en G. Roncador (Spaans National Cancer Research Center, Spanje) voor het vriendelijk verstrekken en helpen bij de anti-p16 INK4 antilichaam, en Dr. S. Godinho en J. Simon (Queen Mary University of London, UK) voor het leveren van muizencellijnen.

Auteur informatie

Affiliaties

  1. The William Harvey Research Institute, Barts and The London School of Medicine, Queen Mary University of London, Charterhouse Square, Londen, EC1M 6BQ, VK
    • Trinidad Montero-Melendez
    • & Mauro Perretti
  2. Centre for Inflammation and Therapeutic Innovation, Queen Mary University of London, London, UK
    • Trinidad Montero-Melendez
    • & Mau ro Perretti
  3. Barts Cancer Institute, Barts and The London School of Medicine, Queen Mary University of London, Charterhouse Square, Londen, EC1M 6BQ , VK
    • Ai Nagano
    • & Claude Chelala
  4. Life Sciences Initiative , Queen Mary University of London, Londen, VK
    • Claude Chelala
  5. NIHR Birmingham Biomedical Research Centre , Universitaire Ziekenhuizen Birmingham NHS Foundation Trust en University of Birmingham, Institute of Inflammation and Aging, Birmingham, Verenigd Koninkrijk
    • Andrew Filer
    • & Christopher D. Buckley
  6. Kennedy Institute of Rheumatology, Nuffield Department of Orthopedics, Rheumatology and Musculoskeletal Sciences, University of Oxford, Oxford, UK
    • Christopher D. Buckley
Auteurs

  1. Zoek naar Trinidad Montero-Melendez in :
  2. Zoek naar Ai Nagano in:
  3. Zoeken voor Claude Chelala in:
  4. Zoek naar Andrew Filer in:
  5. Zoek naar Christopher D. Buckley in:
  6. Zoek naar Mauro Perretti in:

Contributions

MP en T.M.-M. bedacht en ontwierp de studie, verwierf financiering en schreef het manuscript. T.M.-M. ontwierp en voerde alle experimentele delen uit. T.M.-M., A.N. en C.C. geanalyseerde gegevens. T.M.-M., M.P. en C.D.B. geïnterpreteerde gegevens. A.F. leverde menselijke cellen van RA-patiënten. Smp begeleidde de studie. Alle auteurs hebben het manuscript herzien en goedgekeurd.

Corresponderende auteurs

Correspondentie met                  Trinidad Montero-Melendez of Mauro Perretti .

Ethische verklaringen

                               

Concurrerende belangen

                

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

                           

Aanvullende informatie h2>

Informatie over peer review Nature Communications bedankt Daniela Giuliani en de andere, anonieme recensent (en) voor hun bijdrage aan de peer review van dit werk. Er zijn peerreviewer-rapporten beschikbaar.

Noot van de uitgever Springer Nature blijft neutraal ten aanzien van claims in rechtsgebieden in gepubliceerde kaarten en institutionele connecties.

Aanvullende informatie