Notch-signalering stimuleert synoviale fibroblastidentiteit en artritispathologi

Notch-signalering stimuleert synoviale fibroblastidentiteit en artritispathologi

mei 15, 2020 0 Door admin

Translating…


CBD Olie kan helpen bij artrose. Lees hoe op MHBioShop.com


Huile de CBD peut aider avec l’arthrose. Visite HuileCBD.be


 

Abstract

The synovium is a mesenchymal tissue composed mainly of fibroblasts, with a lining and sublining that surround the joints. In rheumatoid arthritis the synovial tissue undergoes marked hyperplasia, becomes inflamed and invasive, and destroys the joint1,2. It has recently been shown that a subset of fibroblasts in the sublining undergoes a major expansion in rheumatoid arthritis that is linked to disease activity3,4,5; however, the molecular mechanism by which these fibroblasts differentiate and expand is unknown. Here we identify a critical role for NOTCH3 signalling in the differentiation of perivascular and sublining fibroblasts that express CD90 (encoded by THY1). Using single-cell RNA sequencing and synovial tissue organoids, we found that NOTCH3 signalling drives both transcriptional and spatial gradients—emanating from vascular endothelial cells outwards—in fibroblasts. In active rheumatoid arthritis, NOTCH3 and Notch target genes are markedly upregulated in synovial fibroblasts. In mice, the genetic deletion of Notch3 or the blockade of NOTCH3 signalling attenuates inflammation and prevents joint damage in inflammatory arthritis. Our results indicate that synovial fibroblasts exhibit a positional identity that is regulated by endothelium-derived Notch signalling, and that this stromal crosstalk pathway underlies inflammation and pathology in inflammatory arthritis.

Data availability

The RNA-seq data that support this work are available at ImmPort (https://www.immport.org) under accession code SDY1599 for human studies, and at the Gene Expression Omnibus (GEO) under accession code GSE145286 for mouse studies. UMAP projections and normalized counts for the human and mouse scRNA-seq data are available at https://portals.broadinstitute.org/single_cell/study/SCP469.

Code availability

All code required for data analyses and figure preparation are available at http://github.com/immunogenomics/notch.

References

  1. 1.

    McInnes, I. B. & Schett, G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis. N. Engl. J. Med. 365, 2205–2219 (2011).

  2. 2.

    Dakin, S. G. et al. Pathogenic stromal cells as therapeutic targets in joint inflammation. Nat. Rev. Rheumatol. 14, 714–726 (2018).

  3. 3.

    Zhang, F. et al. Defining inflammatory cell states in rheumatoid arthritis joint synovial tissues by integrating single-cell transcriptomics and mass cytometry. Nat. Immunol. 20, 928–942 (2019).

  4. 4.

    Mizoguchi, F. et al. Functionally distinct disease-associated fibroblast subsets in rheumatoid arthritis. Nat. Commun. 9, 789 (2018).

  5. 5.

    Croft, A. P. et al. Distinct fibroblast subsets drive inflammation and damage in arthritis. Nature 570, 246–251 (2019).

  6. 6.

    Korsunsky, I. et al. Fast, sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat. Methods 16, 1289–1296 (2019).

  7. 7.

    Traag, V. A., Waltman, L. & van Eck, N. J. From Louvain to Leiden: guaranteeing well-connected communities. Sci. Rep. 9, 5233 (2019).

  8. 8.

    Stephenson, W. et al. Single-cell RNA-seq of rheumatoid arthritis synovial tissue using low-cost microfluidic instrumentation. Nat. Commun. 9, 791 (2018).

  9. 9.

    Palmer, D. G., Selvendran, Y., Allen, C., Revell, P. A. & Hogg, N. Features of synovial membrane identified with monoclonal antibodies. Clin. Exp. Immunol. 59, 529–538 (1985).

  10. 10.

    Rhee, D. K. et al. The secreted glycoprotein lubricin protects cartilage surfaces and inhibits synovial cell overgrowth. J. Clin. Invest. 115, 622–631 (2005).

  11. 11.

    Qiu, X. et al. Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories. Nat. Methods 14, 979–982 (2017).

  12. 12.

    Driskell, R. R. et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature 504, 277–281 (2013).

  13. 13.

    Rinn, J. L., Bondre, C., Gladstone, H. B., Brown, P. O. & Chang, H. Y. Anatomic demarcation by positional variation in fibroblast gene expression programs. PLoS Genet. 2, e119 (2006).

  14. 14.

    Kiselev, V. Y., Yiu, A. & Hemberg, M. scmap: projection of single-cell RNA-seq data across data sets. Nat. Methods 15, 359–362 (2018).

  15. 15.

    Choy, L. et al. Constitutive NOTCH3 signaling promotes the growth of basal breast cancers. Cancer Res. 77, 1439–1452 (2017).

  16. 16.

    Liu, H., Kennard, S. & Lilly, B. NOTCH3 expression is induced in mural cells through an autoregulatory loop that requires endothelial-expressed JAGGED1. Circ. Res. 104, 466–475 (2009).

  17. 17.

    van Groningen, T. et al. A NOTCH feed-forward loop drives reprogramming from adrenergic to mesenchymal state in neuroblastoma. Nat. Commun. 10, 1530 (2019).

  18. 18.

    Monach, P. A., Mathis, D. & Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr. Protoc. Immunol. 81, 15.22.1–15.22.12 (2008).

  19. 19.

    Krebs, L. T. et al. Characterization of Notch3-deficient mice: normal embryonic development and absence of genetic interactions with a Notch1 mutation. Genesis 37, 139–143 (2003).

  20. 20.

    Nigrovic, P. A. et al. Mast cells contribute to initiation of autoantibody-mediated arthritis via IL-1. Proc. Natl Acad. Sci. USA 104, 2325–2330 (2007).

  21. 21.

    Yu, J., Siebel, C. W., Schilling, L. & Canalis, E. An antibody to Notch3 reverses the skeletal phenotype of lateral meningocele syndrome in male mice. J. Cell. Physiol. 235, 210–220 (2019).

  22. 22.

    Wu, Y. et al. Therapeutic antibody targeting of individual Notch receptors. Nature 464, 1052–1057 (2010).

  23. 23.

    Nakazawa, M. et al. Role of Notch-1 intracellular domain in activation of rheumatoid synoviocytes. Arthritis Rheum. 44, 1545–1554 (2001).

  24. 24.

    Park, J.-S. et al. Inhibition of notch signalling ameliorates experimental inflammatory arthritis. Ann. Rheum. Dis. 74, 267–274 (2015).

  25. 25.

    Gao, W. et al. Hypoxia and STAT3 signalling interactions regulate pro-inflammatory pathways in rheumatoid arthritis. Ann. Rheum. Dis. 74, 1275–1283 (2015).

  26. 26.

    Vanlandewijck, M. et al. A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature. Nature 554, 475–480 (2018).

  27. 27.

    Moor, A. E. et al. Spatial reconstruction of single enterocytes uncovers broad zonation along the intestinal villus axis. Cell 175, 1156–1167.e15 (2018).

  28. 28.

    Turley, S. J., Fletcher, A. L. & Elpek, K. G. The stromal and haematopoietic antigen-presenting cells that reside in secondary lymphoid organs. Nat. Rev. Immunol. 10, 813–825 (2010).

  29. 29.

    Ando, K. et al. Peri-arterial specification of vascular mural cells from naïve mesenchyme requires Notch signaling. Development 146, dev165589 (2019).

  30. 30.

    Ando, K. et al. Induction of Notch signaling by tumor necrosis factor in rheumatoid synovial fibroblasts. Oncogene 22, 7796–7803 (2003).

  31. 31.

    Donlin, L. T. et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Res. Ther. 20, 139 (2018).

  32. 32.

    Stoeckius, M. et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19, 224 (2018).

  33. 33.

    Picelli, S. et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat. Protoc. 9, 171–181 (2014).

  34. 34.

    McInnes, L. & Healy, J. UMAP: Uniform Manifold Approximation and Projection for Dimension Reduction. Preprint at https://arxiv.org/abs/1802.03426 (2018).

  35. 35.

    Young, M. D. & Behjati, S. SoupX removes ambient RNA contamination from droplet based single cell RNA sequencing data. Preprint at https://www.biorxiv.org/content/10.1101/303727v1.abstract (2018).

  36. 36.

    Kiener, H. P. et al. Cadherin 11 promotes invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes. Arthritis Rheum. 60, 1305–1310 (2009).

  37. 37.

    Kiener, H. P., Lee, D. M., Agarwal, S. K. & Brenner, M. B. Cadherin-11 induces rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes to form lining layers in vitro. Am. J. Pathol. 168, 1486–1499 (2006).

  38. 38.

    Nguyen, H. N. et al. Autocrine loop involving IL-6 family member LIF, LIF receptor, and STAT4 drives sustained fibroblast production of inflammatory mediators. Immunity 46, 220–232 (2017).

  39. 39.

    Lee, D. M. et al. Cadherin-11 in synovial lining formation and pathology in arthritis. Science 315, 1006–1010 (2007).

  40. 40.

    Delgado, M., Abad, C., Martinez, C., Leceta, J. & Gomariz, R. P. Vasoactive intestinal peptide prevents experimental arthritis by downregulating both autoimmune and inflammatory components of the disease. Nat. Med. 7, 563–568 (2001).

  41. 41.

    Kiener, H. P. et al. Synovial fibroblasts self-direct multicellular lining architecture and synthetic function in three-dimensional organ culture. Arthritis Rheum. 62, 742–752 (2010).

  42. 42.

    O’Brien, W. et al. RANK-independent osteoclast formation and bone erosion in inflammatory arthritis. Arthritis Rheumatol. 68, 2889–2900 (2016).

  43. 43.

    Graeber, T. G. & Eisenberg, D. Bioinformatic identification of potential autocrine signaling loops in cancers from gene expression profiles. Nat. Genet. 29, 295–300 (2001).

Download references

dby = “Ack1″>

Dankwoord

Dit werk werd ondersteund door R01 AR063709, R01 AR073833 en T32 AR007530-31 (tot MBB ); R01 AR063759, U01 HG009379 en UH2 AR067677 (aan S.R.); Scientology Development Award van de Reumatologie Research Foundation (aan K.W.); KL2-onderscheiding (een benoemde KL2-onderscheiding) van Harvard Catalyst | Het Harvard Clinical and Translational Science Center (National Center for Advancing Translational Sciences, National Institutes of Health Award KL2 TR002542) (aan K.W.); en een Joint Biology Consortium Microgrant (aan K.W.). M.B.B., S.R., I.K., J.L.M. en K.W. werden gefinancierd als onderdeel van een samenwerkingsovereenkomst voor onderzoek met F. Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Zwitserland). Dit rapport bevat onafhankelijk onderzoek dat wordt ondersteund door het National Institute for Health Research via het Birmingham Biomedical Research Center en Wellcome Trust Clinical Research Facility bij University Hospitals Birmingham NHS Foundation Trust. De standpunten zijn die van de auteur (s) en niet noodzakelijk die van de NHS, de NIHR, onze financierende instanties of het ministerie van Volksgezondheid. Financiering werd ook verstrekt door het Versus Arthritis RACE Rheumatoid Arthritis Pathogenesis Center of Excellence (Grant 20298) en Versus Arthritis Program Grant aan C.D.B. en A.F. (verlening 19791). A.P.C. werd ondersteund door een Wellcome Trust Clinical Career Development Fellowship nr. WT104551MA. C.D.B. en T.M. worden ondersteund door financiering van de Kennedy Trust for Rheumatology Research als onderdeel van het Arthritis Therapy Acceleration Program. We danken de BWH Single Cell Genomics Core voor hulp bij scRNA-seq experimenten. We bedanken de leden van het laboratorium van Brenner en Raychaudhuri voor discussies. We erkennen de University of Birmingham Medical School Imaging Suite en de hulp van R. Shaw.

Auteursinformatie

Auteur-opmerkingen

  1. Deze auteurs hebben evenveel bijgedragen: Kevin Wei, Ilya Korsunsky

  2. Deze auteurs hebben gezamenlijk toezicht gehouden op dit werk: Soumya Raychaudhuri , Michael B. Brenner

Affiliaties

  1. Afdeling Reumatologie, Ontsteking en Immunity, Brigham and Women’s Hospital en Harvard Medical School, Boston, MA, USA
    • Kevin Wei
    • , Ilya Korsunsky
    • , Anqi Gao li>
    • , Gerald FM Watts
    • , Jordan Watts
    • , William Apruzzese
    • , Ellen M. Gravallese
    • , A Helena Jonsson
    • , Deepak A. Rao
    • , Soumya Raychaudhuri li>
    • & Michael B. Brenner
  2. Center for Data Sciences, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, VS span>
    • Ilya Korsunsky
    • , Chamith Y. Fonseka
    • , Maria Gutierrez-Arcelus
    • , Joseph R. Mears
    • , Kamil Slowikowski
    • , Fan Zhang
    • & Soumya Raychaudhuri

  3. Divisie of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, USA
    • Ilya Korsunsky
    • , Chamith Y. Fonseka
    • , Maria Gutierrez-Arcelus
    • , Joseph R. Mears
    • , Kamil Slowikowski
    • , Fan Zhang
    • & Soumya Raychaudhuri
  4. Afdeling Biomedische Informatica, Harvard Medical School, Boston, MA, VS
    • Ilya Korsunsky
    • , Chamith Y. Fonseka
    • , Maria Gutierrez-Arcelus
    • , Joseph R. Mears
    • , Kamil Slowikowski
    • , Fan Zhang
    • & Soumya Raychaudhuri
  5. Programma in medische en populatiegenetica, Broad Institute of MIT en Harvard, Cambridge, MA, VS
    • Ilya Korsunsky
    • , Chamith Y. Fonseka
    • , Maria Gutierrez-Arcelus
    • , Joseph R. Mears
    • , Kamil Slowikowski
    • , Fan Zhang
    • & Soumya Raychaudhuri
  6. Rheumatology Research Group, Institute for Inflammation and Aging, NIHR Birmingham Biomedical Research Centre en Clinical Research Facility, University of Birmingham, Queen Elizabeth Hospital, Birmingham, UK
    • Jennifer L. Marshall
    • , Triin Major
    • , Adam P . Croft
    • , Andrew Filer
    • , Karim Raza
    • , Jason D. Turner
    • & Christopher D. Buckley
  7. Afdeling Orthopedische Heelkunde, Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA, VS
    • Philip E. Blazar li>
    • , Jeffrey K. Lange
    • & Thomas S. Thornhill
  8. Arthritis and Tissue Degeneration, Hospital for Special Surgery, New York, NY, USA
    • Laura T. Donlin
    • , Vivian P. Bykerk
    • , Susan M. Goodman

  9. , Michael A. McNamara
  10. & Dana E. Orange
  11. Afdeling Discovery Oncology, Genentech, South San Francisco, CA, USA
    • Christian W. Siebel
  12. The Kennedy Institute of Rheumatology, University of Oxford, Oxford, UK
    • Christopher D. Buckley
  13. Centre for Genetics and Genomics Versus Arthritis, Centre for Musculoskeletal Research, Manchester Academic Health Science Centre, The University of Manchester, Manchester, UK
    • Soumya Raychaudhuri
    • ul>

  14. Afdeling Allergie, Immunologie en Reumatologie, Afdeling Geneeskunde, University of Rochester Medical Center, Rochester, NY, VS
    • Jennifer Albrecht
    • , Jennifer H. Anolik
    • , Brendan F. Boyce

  15. , Nida Meednu
  16. , Javier Rangel-Moreno
  17. , Christopher Ritchlin
  18. & Darren Tabechian
  19. Afdeling Geneeskunde, Afdeling Reumatologie, Allergie en Immunologie, Universiteit van Californië, San Diego, La Jolla, CA, VS span >
    • David L. Boyle
    • & Gary S. Firestein

  20. Afdeling Klinische Immunologie and Rheumatology, Department of Medicine, University of Alabama in Birmingham, Birmingham, AL, USA
    • S. Louis Bridges Jr
    • & Laura B. Hughes
  21. Translationeel onderzoeksprogramma, Benaroya Research Institute in Virginia Mason, Seattle , WA, VS
    • Jane H. Buckner
    • & Eddie A. James
  22. Afdeling Pathologie en Laboratoriumgeneeskunde, Ziekenhuis voor Speciale Chirurgie, New York, NY, VS
    • Edward DiCarlo
  23. Department of Surgery, Brigham and Women’s Hospital en Harvard Medical School, Boston, MA, USA
    • James Dolan
    • , Josh Keegan
    • , James A. Lederer
    • , Jennifer P. Nguyen
    • & Anupamaa Seshadri
  24. Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA
    • Thomas M. Eisenhaure
    • , Nir Hacohen
    • , David J. Lieb
    • , Chad Nusbaum
    • , Akiko Noma
    • & Danielle Sutherby
  25. Feinstein Institute for Medical Research, Northw ell Health, Manhasset, NY, VS
    • Peter K. Gregersen
  26. Department of Arthritis & Clinical Immunology, Oklahoma Medical Research Foundation, Oklahoma City, OK, USA
    • Joel M. Guthridge
    • & Judith A. James

    li >

  27. Afdeling Reumatologie, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO, VS
    • V. Michael Holers
    • & Jennifer Seifert
  28. Graduate Program in Immunology and Microbial Pathogenesis, Weill Cornell Graduate School of Medical Sciences , New York, NY, VS
    • Lionel B. Ivashkiv
  29. David Z. Rosensweig Genomics Research Centrum, ziekenhuis voor speciale chirurgie, New York, NY, VS
    • Lionel B. Ivashkiv
  30. Afdeling Reumatologie, Barts Health NHS Trust, Londen, VK
    • Stephen Kelly
  31. Afdeling Reumatologie , Department of Medicine, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Chicago, IL, USA
    • Yvonne C. Lee
    • , Arthur M. Mandelin II
    • & Harris Perlman
  32. Afdeling Reumatologie en Klinische Immunologie, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, VS
    • Mandy J. McGeachy
    • & Larry Moreland
  33. Afdeling Reumatologie, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, Tokyo, Japan
    • Fumitaka Mizoguchi
  34. Centrum voor Experimentele Geneeskunde & Reumatologie, William Harvey Research Institute, Queen Mary University of London, Londen, VK
    • Costantino Pitzalis li>
  35. Afdeling Immunologie en Reumatologie, Afdeling Geneeskunde, Stanford University School of Medicine, Palo Alto, CA, VS
    • Mina Rohani-Pichavant
    • , William H. Robinson
    • & Paul J. Utz
  36. Het Instituut voor immuniteit, transplantatie en infectie, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, VS
    • Mina Rohani-Pichavant
    • , William H. Robinson
    • & Paul J. Utz
  37. Afdeling Reumatologie, Afdeling Geneeskunde, University of Massachusetts Medical School, W orcester, MA, VS
    • Karen Salomon-Escoto
Auteurs

  1. Kevin Wei
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in div>
  2. Ilya Korsunsky
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in
  3. Jennifer L. Marshall
    Je kunt deze auteur ook zoeken in
  4. Anqi Gao
    Je kunt hier ook naar zoeken auteur in
  5. Gerald FM Watts
    Je kunt ook zoek naar deze auteur in
  6. Triin Major
    Jij kan ook naar deze auteur zoeken in
  7. Adam P. Croft
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in
  8. Jord an Watts
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in
  9. Philip E. Blazar
    Je kunt deze auteur ook zoeken in
  10. Jeffrey K. Lange
    Je kunt deze auteur ook zoeken in
  11. Thomas S. Thornhill
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in

    li >

  12. Andrew Filer
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in

  13. Karim Raza
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in

    div >

  14. Laura T. Donlin
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in div >
  15. Christian W. Siebel
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in span >

  16. Christopher D. Buckley
    Je kunt ook naar deze auteur zoeken in
  17. Soumya Raychaudhuri
    Je kunt deze auteur ook zoeken in
  18. Michael B. Brenner
    Je kunt deze auteur ook zoeken in
  19. div>

    Consortia

    Accelerating Medicines Partnership Reumatoïde artritis en systemische lupus erythematodes (AMP RA / SLE) Consortium

      , Fumitaka Mizoguchi

    • , Harris Perlman
    • , Anupamaa Seshadri

    Bijdragen

    K.W. en I.K. het project geconceptualiseerd, experimenten uitgevoerd, gegevens geanalyseerd en het manuscript mede geschreven. J.L.M. en T.M. immunofluorescentiemicroscopie uitgevoerd en gegevens geanalyseerd. A.G., G.F.M.W. en J.W. experimenten uitgevoerd en gegevens geanalyseerd. M.B.B. en S.R. bedacht het project, begeleidde het werk en schreef mee aan het manuscript. C.D.B., A.P.C., A.F. en K.R. nam deel aan studieontwerp, monsteracquisitie en analyse en begeleidde het confocale en digitale beeldvormingsplatform in Birmingham. P.E.B., J.K.L., L.T.D. en T.S.T. nam deel aan studieontwerp en steekproefverwerving. C.W.S. genereerde het NOTCH3-blokkerende antilichaam en hielp bij de opzet van de studie. Alle auteurs bespraken de resultaten en gaven commentaar op het manuscript.

    Corresponderende auteurs

    Correspondentie met                  Soumya Raychaudhuri een> of Michael B. Brenner .

Ethische verklaringen

                           

Concurrerende belangen

              

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

                       

Aanvullende informatie h2>

Informatie over peer review Nature bedankt Sakae Tanaka, Shannon Turley en de andere, anonieme reviewer (s) ) voor hun bijdrage aan de intercollegiale toetsing van dit werk.

Opmerking van de uitgever Springer Nature blijft neutraal met betrekking tot jurisdictieclaims in gepubliceerde kaarten en institutionele affiliaties.

div>

Uitgebreide gegevenscijfers en tabellen

Uitgebreide gegevens Fig. 1 Karakterisering van synoviale stromale cellen door scRNA-seq en flowcytometrie.

een projectie van UMAP van scRNA-seq-gegevens van 35.153 stromale synoviale cellen van 12 donoren vóór Harmony-integratie (links) en na Harmony-integratie (rechts). Elke cel is gekleurd door donorbron. b , Gemiddelde expressie van stromale markers (kleur) en percentage cellen die deze markers (grootte) tot expressie brengen tussen fibroblasten in de bekleding, fibroblasten in de onderlaag, murale cellen en endotheelcellen. c , expressie van voeringmarkering PRG4 en subliniëringmarkering THY1 in UMAP-projectie. d , UMAP-inbedding van fibroblasten en muurschilderingcellen gekleurd door hun afgeleide positie langs de positionele as van 0 (perivasculaire pool) tot 100 (voeringpool). e , representatief flowcytometrisch poortschema voor de analyse van synoviale stromacellen. Intacte cellen worden geïdentificeerd op basis van forward scatter (FSC-A) en side scatter (SSC-A) kenmerken. Dode cellen (PI ), rode bloedcellen (CD235a ) en leukocyten (CD45 ) zijn uitgesloten van analyse. Endotheelcellen (CD31 CD146 ) en muurschilderingcellen (CD31 CD146 ) zijn te onderscheiden van synoviaal fibroblasten op basis van CD146-expressie. Binnen de CD31 CD146 poort, fibroblasten (PDPN CD90 ) voering en fibroblasten (PDPN CD90 ) kan worden geïdentificeerd. Het rode venster geeft tussenproducten tussen celtypen aan. f , Flowcytometrische kwantificering van stromale celpopulaties in de synoviale weefsels van patiënten met reumatoïde artritis ( n = 9) en artrose ( n = 11 ). Het gemiddelde percentage endotheelcellen (rood), murale cellen (blauw), fibroblasten aan de binnenkant (bruin) en fibroblasten aan de onderzijde (groen) van de totale stromale (CD45 ) cellen worden weergegeven. g , Dichtheidsgrafiek die het fibroblastgehalte toont in de synoviale weefsels van patiënten met reumatoïde artritis (oranje) en artrose (blauw) ( n = 6) langs de positionele as. h , Archetypische analyse wees elke cel een kansverdeling toe over de zes biologisch gedefinieerde archetypen, evenals het archetype dat omgevings-mRNA (achtergrond) vertegenwoordigt. De verwarringmatrix geeft de kans weer dat een cel met een bekend type ( y as) wordt toegewezen aan een van de zeven archetypen ( x as). Elke rij is genormaliseerd tot 1. i , de positionele identiteit ( x as) van elke fibroblast, uitgezet tegen de waarschijnlijkheid dat de cel is geclassificeerd als het archetype van het omgevings-RNA ( y as). j , Heatmap met de transcriptionele gradiënten langs de positionele as. k , Pathway-verrijking van 71 genen in de intermediaire groep in j , met behulp van biologische methoden van Gene Ontology.                          Brongegevens                       

Uitgebreide gegevens Fig. 2 Ruimtelijke analyse van synoviale fibroblast positionele markers.

a , genormaliseerde expressie (log (CP10K)) van positiegeassocieerde fibroblastmarkers CD55 (links), GGT5 (midden) en PDPN (rechts) langs de positionele as. b , representatieve microscopische afbeeldingen van synoviale weefsels waarin CD55 (geel), CD90 (groen), CD146 (blauw) en VWF (rood) worden gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring. c , als endotheelcellen gelabelde cellen zijn rood gekleurd en fibroblasten zijn gekleurd van lage CD90: CD55-verhouding (grijs) tot hoge CD90: CD55-verhouding (blauw). d , Ruimtelijke correlatie tussen de fibroblast CD90: CD55-verhouding en de afstand tot de dichtstbijzijnde endotheelcel. e , representatief microscopisch beeld van synoviale weefsels waarin PDPN (rood), GGT5 (groen) en CD31 (blauw) worden gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring. f , cellen die als endotheelcellen zijn gemarkeerd, zijn rood gekleurd en fibroblasten zijn gekleurd van een lage GGT5: PDPN-verhouding (grijs) tot een hoge GGT5: PDPN-verhouding (blauw). g , Ruimtelijke correlatie tussen de fibroblast GGT5: PDPN-verhouding en de afstand tot de dichtstbijzijnde endotheelcellen. Voor b d werden synoviale weefselmonsters geanalyseerd van n = 4 patiënten met reumatoïde artritis en n = 5 patiënten met artrose. Voor e g werden synoviale weefsels verkregen van n = 7 patiënten met reumatoïde artritis. Zie Aanvullende gegevens voor individuele afbeeldingen en ruimtelijke analyse. Voor d en g werden Spearman-correlatiewaarden en significantie berekend met de basis R cor.test-functie. Cellen werden door frequentie in groepen van 50 cellen langs de x as gebundeld en gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde en 95% betrouwbaarheidsinterval. Zie aanvullende gegevens 2 4 voor alle uitgevoerde afbeeldingen en ruimtelijke analyse.                          Brongegevens                       

Uitgebreide gegevens Fig. 3 Endotheelcellen mediëren de differentiatie van THY1 tot expressie brengende fibroblasten.

a , fibroblast positionele identiteitsscores van CD90 (rood) en CD90 (blauw) fibroblasten op het aangegeven doorgangsnummer (vers, n = 7 en n i> = 15; passage 1, n = 7 en n = 16; passage 2, n = 4 en n ik> = 8). Boxplots vatten het mediaan, interkwartielbereik en 95% kwantielen van de positiewaarden samen. b , positionele identiteit van fibroblasten uit alleen fibroblast (bovenaan, n = 4.336 cellen) en fibroblast endotheelcel (onder, n = 2.076 cellen) organoïden. Cellen worden gekleurd door hun afgeleide positie langs de positionele as van 0 (perivasculaire pool) tot 100 (voeringpool). Perivasculaire fibroblasten (rood) werden gedefinieerd als cellen met een positie van minder dan 20, en tussenliggende fibroblasten werden gedefinieerd als zijnde gelegen op posities tussen 20 en 80. c , Flowcytometrische kwantificering van synoviale CD90 fibroblasten en CD31 endotheelcellen uit 22 synoviale weefsels. d , percentage CD90 fibroblasten op basis van Doppler-echoscores van patiënten met reumatoïde artritis ( n = 20) van de AMP-RA / SLE consortium. e , THY1 expressie gemeten door PCR met reverse transcriptie in fibroblasten na stimulatie met de aangegeven recombinante eiwitten ( n = 3 repliceert voor WNT3A en WNT5A, n = 4 herhalingen voor andere voorwaarden). THY1 -uitdrukking wordt weergegeven als vouwwisseling vergeleken met de voertuigcontrole voor elk staat. De significantie wordt bepaald door een t -test. f h , scRNA-seq analyse van synoviale organoïden ( n = 22.164 cellen van 3 technische replicaten). f , genormaliseerde expressie van definiërend markergen voor celtypen: MKI67 voor prolifererende fibroblasten, VWF voor endotheelcellen en THY i> 1 voor de THY1 high en THY1 low fibroblast-groepen. g , representatie van vier belangrijke celtypes door het aantal cellen in elke organoïde conditie. h , Notch-activeringsscore in fibroblasten afgeleid van organoïden, gescheiden door organoïde conditie. De significantie wordt bepaald door de Spearman-correlatie ( c , d ) en de t -test van één steekproef van de Student ( e ) .                          Brongegevens                       

Uitgebreide gegevens Fig. 4 NOTCH3-signalering in synoviale fibroblasten en muurschilderingcellen.

a , b , expressie van NOTCH1 en NOTCH3 in synoviale stromale cellen zoals bepaald door scRNA-seq. a , expressie van NOTCH1 (boven) en NOTCH3 (onder) in bekledingsfibroblasten (oranje), muurschilderingcellen (rood), onderliggende fibroblasten ( groen) en endotheelcellen (blauw) uit de menselijke primaire synoviale weefselscRNA-seq dataset ( n = 35.153 cellen uit de synoviale weefsels van 6 patiënten met reumatoïde artritis en 6 patiënten met artrose). b , Muurschilcellen werden onderverdeeld in twee belangrijke muurpopulaties: vasculaire gladde spiercellen (oranje) en pericytes (blauw). Er werd geen verschil in de expressie van NOTCH3 waargenomen (Wilcoxon rank-sum test P = 0.86) tussen deze twee subpopulaties. c , representatieve synoviale weefselcoupes ( n = 6) die RNAscope-kleuring tonen voor NOTCH3 in paars, immunohistochemische kleuring (IHC) voor CD90 in bruin en kernen in blauw. De arteriole is gemarkeerd met een driehoek. d , de gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van NOTCH3 in synoviale murale cellen ( n = 18), onderafdeling van fibroblasten ( n = 40), voering fibroblasten ( n = 20), endotheelcellen ( n = 15) en leukocyten ( n = 19). Boxplots vatten het mediaan, interkwartielbereik en 95% kwantielbereik samen, en de significantie wordt bepaald door Spearman-correlatie. e , representatieve immunohistochemie afbeelding die de kleuring toont van het NOTCH3 intracellulaire domein (NOTCH3-ICD) in het synoviaal weefsel van een patiënt met reumatoïde artritis ( n = 3). A, arterieel endotheel; V, veneus endotheel. f , immunoblot van synoviale fibroblastlysaten behandeld met antilichamen tegen het NOTCH3 intracellulaire domein (NICD3, boven) of GAPDH (onder). De behandelingen waren als volgt: 10 mmol EDTA (Notch-activering), plaat-gecoate DLL4 (5 μg ml −1 ) of plaat-gecoate JAG1 (5 μg ml −1 sup >), in aanwezigheid of afwezigheid van 10 μM DAPT (γ-secretaseremmer). n = 3 onafhankelijke experimenten. Zie Aanvullende gegevens 1 .                          Brongegevens                       

Uitgebreide gegevens Fig. 5 Endotheelcellen induceren de expressie van NOTCH3 en JAG1 in fibroblasten.

een analyse van fijne clusters van synoviaal weefsel endotheelcel scRNA-seq data: arteriële PODXL (oranje) en veneuze DARC (blauwe) subtypes worden gemarkeerd in UMAP-projectie. Alle niet-vasculaire endotheelcellen zijn grijs gekleurd. n = 35.153 cellen uit de synoviale weefsels van 6 patiënten met reumatoïde artritis en 6 met artrose. b , gemiddelde expressie (kleur) en percentage cellen met niet-nul expressie (grootte) van topgenmarkers die arteriële en veneuze endotheelcellen onderscheiden. c , confocale microscopiebeelden van synoviale weefsels waarin NOTCH3 (rood), CD90 (groen) en PODXL (blauw) worden gevisualiseerd door immunofluorescentiekleuring. d , afbeeldingen van c werden vervolgens verwerkt om cellen te segmenteren en hun ruimtelijke locatie en gemiddelde intensiteit van alle drie de markers weer te geven. Cellen die zijn gelabeld als arteriële vasculaire endotheelcellen zijn rood gekleurd en niet-arteriële endotheelcellen zijn gekleurd volgens NOTCH3-expressie, van laag (grijs) tot hoog (blauw). e , ruimtelijke correlatie tussen de expressie van NOTCH3 en de afstand van de dichtstbijzijnde arteriële vasculaire endotheelcel. Niet-arteriële cellen in elk beeld werden gebruikt om de functie tussen arteriële afstand te analyseren, gemeten door afstand tot de dichtstbijzijnde arteriële vasculaire endotheelcellen en NOTCH3-expressie. Spearman-correlatiewaarden en significantie werden berekend met de basis R cor.test-functie. Cellen werden door frequentie in groepen van 50 cellen langs de x -as gebundeld. f , g , flowcytometrische analyse van fibroblasten en endotheelcelcultuurexperimenten. Cellen worden gepoort op CD31 CD90 fibroblasten om endotheelcellen uit te sluiten ( n = 4 replicaten). f , representatieve stroomgrafiek van NOTCH3-, CD90- en JAG1-expressie in de fibroblast-only cultuur (links) en de fibroblast endotheelcel co-cultuur (rechts). Kleur geeft het expressieniveau van JAG1 in fibroblasten aan. g , gemiddelde fluorescentie-intensiteit die de expressie van JAG1 in fibroblasten laat zien in aanwezigheid en afwezigheid van endotheelcellen (EC), de γ-secretaseremmer DAPT, of na voorbehandeling met controle siRNA of siRNA tegen NOTCH3 (si NOTCH3 ). Boxplots vatten het mediaan, interkwartielbereik en 95% kwantielbereik samen. h , Biaxiale plots van genormaliseerde JAG1 en NOTCH3 -uitdrukking (in CP10K) uit de scRNA-seq-gegevens van synoviale weefsels (top, n = 12 donoren) en synoviale organoïden (onder, n = 3 organoïden).

Uitgebreide gegevens Fig. 6 NOTCH3-expressie in muissynovia en de effecten van remming van NOTCH3 of NOTCH1.

a , seriële secties van de synovia van artritische muizen ( n = 5) die representatieve hematoxyline- en eosinekleuring (top) en immunofluorescentie vertonen kleuring (onderkant) van CD45 (rood), NOTCH3 (groen) en DAPI (blauw). b , representatieve hematoxyline- en eosinekleuring van muisgewrichten van wildtype muizen (top, n = 6) en Notch3 – / – muizen (onder, n = 6). S, synovium. c , scRNA-seq van wildtype, Notch 3 – / – , isotype control- of anti-NRR3-behandelde synoviale muiscellen (totaal n = 18.491 cellen van n = 10 muizen per groep). Cellen werden geclusterd en gelabeld in een gezamenlijke analyse. In de zeven geïdentificeerde stromale populaties werd differentiële genexpressie uitgevoerd voor anti-NRR3 vergeleken met isotypecontrole en voor Notch3 – / – vergeleken met wildtype. Elk gen werd uitgezet als een stip, die de log-getransformeerde vouwverandering voorstelt. d , e , klinische index ( d ) en zwelling van de poot ( e ) bij met IgG-controle-antilichaam behandeld ( donkerblauwe, n = 20) of met anti-NRR1 behandelde (lichtblauwe, n = 20) muizen na serumoverdracht van K / BxN-muizen. De significantie van elke behandeling werd bepaald door lineaire modellen met gemengde effecten, waarbij de tijd werd gecontroleerd als een categorisch vast effect en muis als een willekeurig effect. f , g , UMAP-projecties van genormaliseerde expressie van NOTCH1 in scRNA-seq-gegevens van menselijk primair weefsel ( n = 35.153 cellen) ( f ) en Notch1 in scRNA-seq-gegevens van muis ( n = 18.491 cellen) ( g ).

Uitgebreide gegevens Fig. 7 Karakterisering van tussenliggende fibroblast positionele gensignatuur.

a , Genverrijkingsscores voor tussenliggende positiespecifieke genen ( x ) uitgezet tegen Notch-activeringsscore ( y ) in synoviale organoïden ( n = 22.164 cellen; n = 3 organoïden per aandoening) . DAPT geeft aan dat organoïden werden gekweekt in aanwezigheid van 10 μM γ-secretaseremmer DAPT. De fibroblast endotheelcelorganoïden (geel) vertonen tekenen van verhoogde Notch-signalering, maar weinig verrijking in genen van de tussenliggende zone, in vergelijking met fibroblasten die alleen (blauw) of in aanwezigheid van DAPT (rood) werden gekweekt. b , Verrijking van intermediaire genscore in synoviale fibroblasten van muizen. Verrijking is het laagst (rood) in de eerder geïdentificeerde voering- en onderlaagzones en het hoogst (blauw) in de fibroblasten die tussen de twee zones zijn gepositioneerd, in de tussenliggende zone. c , Verrijking van vooraf gedefinieerde synoviale fibroblastpopulaties in de AMP-RA / SLE scRNA-seq dataset ( n = 1.844 cellen).

Aanvullende informatie

                                                                                                                                                                                                         

aanvullende informatie

Dit bestand bevat: 1 niet-bijgesneden scans en aanduidingen voor groottemarkeringen. Controle (GAPDH) werd uitgevoerd met dezelfde gel als controles voor monsterverwerking; 2 , individuele confocale microscopiebeelden gebruikt bij ruimtelijke analyse; 3 , fibroblast positionele markerintensiteit in elk individueel beeld; 4 , ruimtelijke analyse en correlatie tussen afstand tot endotheelcellen en fibroblast positionele markerintensiteit in elk afzonderlijk beeld.

Aanvullende tabel 1

Resultaten van differentiële expressie voor grote populaties geïdentificeerd in synoviaal weefsel en organoid scRNAseq datasets. Dataset verwijst naar de weefsel- en organoïde-datasets. Celtype identificeert de celpopulatie, zoals toegewezen door clusteringanalyse. Symbool geeft de gennaam aan. De AUC is het gebied onder de curve van de operator van de ontvanger en weerspiegelt overexpressie (> 0,5) of onderexpressie (

aanvullend Tabel 2

950 genen geclusterd langs het fibroblast positionele traject. De tweede kolom verwijst naar de hiërarchisch geclusterde groepen, zoals gekleurd in Uitgebreide gegevens Fig. 1h. De derde kolom beschrijft de positionele associatie van dat gen: sublinie, voering of tussenzone.

Aanvullende tabel 3 a>

Gegevens gebruikt voor gekwantificeerde beeldanalyse van CD90: PRG4-verhouding. Elke rij vertegenwoordigt een gesegmenteerde cel. Voorbeeld en afbeeldingsnummer geven de donor en het afbeeldingsnummer van die donor aan. center_x en center_y zijn de x- en y-ruimtelijke coördinaten van het midden van de cel in de afbeelding. THY1 (CD90), PRG4, VWF en MCAM vertegenwoordigen per beeld geschaalde intensiteitswaarden van de overeenkomstige markeringen. Regio werd handmatig beheerd in de Definiens-software, gebaseerd op morfologie. Ziekte is de klinische status van de donor, ofwel RA voor reumatoïde artritis of OA voor artrose. ncells_image is het aantal cellen dat in die afbeelding is gesegmenteerd. thy1_prg4_ratio is de geschaalde verhouding van CD90 tot PRG4-intensiteit. is_ec rapporteert of de cel een endotheelcel (1) is genoemd of geen endotheelcel (0 of -1). dist_EC is de afstand van die cel tot de dichtstbijzijnde endotheelcel. Deze afstand is alleen gedefinieerd voor niet-endotheelcellen.

Aanvullende tabel 4

Top 1000 genen geassocieerd met de transcriptionele gradiënt van scRNAseq. Voor elk gen construeerden we een lineair model van genexpressie versus gradiëntpositie. De standaarduitvoer van dit lineaire model wordt hier in de kolommen 2 tot en met 6 vermeld. De laatste kolom, geassocieerd met, labelt de genen als meer geassocieerd met het perivasculaire of voeringseinde van de transcriptiegradiënt.

aanvullend Tabel 5

Gegevens gebruikt voor gekwantificeerde beeldanalyse voor CD90: CD55-verhouding. Elke rij vertegenwoordigt een gesegmenteerde cel. Voorbeeld en afbeeldingsnummer geven de donor en het afbeeldingsnummer van die donor aan. center_x en center_y zijn de x- en y-ruimtelijke coördinaten van het midden van de cel in de afbeelding. CD90, CD55, VWF en CD146 vertegenwoordigen geschaalde intensiteitswaarden per afbeelding van de overeenkomstige markeringen. Regio werd handmatig beheerd in de Definiens-software, gebaseerd op morfologie. Ziekte is de klinische status van de donor, ofwel RA voor reumatoïde artritis of OA voor artrose. ncells_image is het aantal cellen dat in die afbeelding is gesegmenteerd. ratio is de schaalverhouding van CD90 tot CD55 intensiteit. is_ec rapporteert of de cel een endotheelcel (1) is genoemd of geen endotheelcel (0 of -1). dist_EC is de afstand van die cel tot de dichtstbijzijnde endotheelcel. Deze afstand is alleen gedefinieerd voor niet-endotheelcellen.

Aanvullende tabel 6

Gegevens gebruikt voor gekwantificeerde beeldanalyse van GGT5: PDPN-ratio. Elke rij vertegenwoordigt een gesegmenteerde cel. Voorbeeld en afbeeldingsnummer geven de donor en het afbeeldingsnummer van die donor aan. center_x en center_y zijn de x- en y-ruimtelijke coördinaten van het midden van de cel in de afbeelding. GGT5, PDPN en CD31 vertegenwoordigen per beeld geschaalde intensiteitswaarden van de corresponderende markeringen. Regio werd handmatig beheerd in de Definiens-software, gebaseerd op morfologie. Ziekte is de klinische status van de donor, ofwel RA voor reumatoïde artritis of OA voor artrose. ncells_image is het aantal cellen dat in die afbeelding is gesegmenteerd. ratio is de geschaalde verhouding van GGT5 tot PDPN-intensiteit. is_ec rapporteert of de cel een endotheelcel (1) is genoemd of geen endotheelcel (0 of -1). dist_EC is de afstand van die cel tot de dichtstbijzijnde endotheelcel. Deze afstand is alleen gedefinieerd voor niet-endotheelcellen.

Aanvullende tabel 7

Resultaten van differentiële expressie gebruikt in de ligandreceptoranalyses. Elke rij is een paar genen waarvan bekend is dat ze deelnemen aan een ligand-receptor signaleringsinteractie. Voor elk ligand-receptorpaar rapporteren we de resultaten van de differentiële expressie-analyse van liganden die opwaarts zijn gereguleerd in endotheelcellen en receptoren die opwaarts zijn gereguleerd in perivasculaire cellen. We rapporteren het percentage niet-nul tot expressie brengende cellen en Benjamini Hochberg gecorrigeerde FDR van een Wilcoxon rank sum differentiële expressietest. Ten slotte rapporteren we de ligand- en receptorpercentages en FDR-statistieken voor zowel het synoviaal weefsel als de gecultiveerde organoïde datasets afzonderlijk.

Aanvullende tabel 8

Gegevens die worden gebruikt voor gekwantificeerde analyse voor afbeeldingen in uitgebreide gegevens. Afb. 5. Elke rij vertegenwoordigt een gesegmenteerde cel. Voorbeeld en afbeeldingsnummer geven de donor en het afbeeldingsnummer van die donor aan. center_x en center_y zijn de x- en y-ruimtelijke coördinaten van het midden van de cel in de afbeelding. CD90, NOTCH3 en PODXL vertegenwoordigen geschaalde intensiteitswaarden per afbeelding van de overeenkomstige markeringen. Regio werd handmatig beheerd in de Definiens-software, gebaseerd op morfologie. Ziekte is de klinische status van de donor, ofwel RA voor reumatoïde artritis of OA voor artrose. ncells_image is het aantal cellen dat in die afbeelding is gesegmenteerd. is_ec rapporteert of de cel een endotheelcel (1) is genoemd of geen endotheelcel (0 of -1). dist_EC is de afstand van die cel tot de dichtstbijzijnde arteriële endotheelcel. Deze afstand is alleen gedefinieerd voor niet-arteriële endotheelcellen.

Aanvullende tabel 9

Differentiële expressieresultaten voor in vitro JAG1- en DLL4-fibroblaststimulatie. Kolommen 2 tot 7 verwijzen naar JAG1-stimulatie; kolommen 8 tot 13 verwijzen naar DLL4-stimulatie. De kolommen zijn de standaard output van limma differentiële expressie analyse: logFC is log fold verandering van gestimuleerde vs niet gestimuleerde samples, AveExpr is de gemiddelde expressie van het gen in alle samples, t is de gematigde student’s t statistiek, P.Value is de nominale p waarde, adj.P.Val is de Benjamini Hochberg aangepaste FDR, B is de gemodereerde B-statistiek.

Over dit artikel

Citeer dit artikel

Wei, K., Korsunsky, I., Marshall, JL et al. i> Notch-signalering stimuleert synoviale fibroblastidentiteit en artritispathologie.                      Natuur (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-2222-z

Download citaat use >

div>

Reacties

Door een opmerking te plaatsen, gaat u akkoord met onze voorwaarden en Communityrichtlijnen . Als je iets beledigend vindt of dat niet voldoet aan onze voorwaarden of richtlijnen, markeer het dan als ongepast.

                                                                      

Lees Meer