Mutaties die caspase-splitsing van RIPK1 voorkomen, veroorzaken auto-inflammatoire ziekt

Mutaties die caspase-splitsing van RIPK1 voorkomen, veroorzaken auto-inflammatoire ziekt

december 14, 2019 0 Door admin


CBD Olie kan helpen bij artrose. Lees hoe op

Huile de CBD peut aider avec l’arthrose. Visite



RIPK1 is a key regulator of innate immune signalling pathways. To ensure an optimal inflammatory response, RIPK1 is regulated post-translationally by well-characterized ubiquitylation and phosphorylation events, as well as by caspase-8-mediated cleavage1,2,3,4,5,6,7. The physiological relevance of this cleavage event remains unclear, although it is thought to inhibit activation of RIPK3 and necroptosis8. Here we show that the heterozygous missense mutations D324N, D324H and D324Y prevent caspase cleavage of RIPK1 in humans and result in an early-onset periodic fever syndrome and severe intermittent lymphadenopathy—a condition we term ‘cleavage-resistant RIPK1-induced autoinflammatory syndrome’. To define the mechanism for this disease, we generated a cleavage-resistant Ripk1D325A mutant mouse strain. Whereas Ripk1−/− mice died postnatally from systemic inflammation, Ripk1D325A/D325A mice died during embryogenesis. Embryonic lethality was completely prevented by the combined loss of Casp8 and Ripk3, but not by loss of Ripk3 or Mlkl alone. Loss of RIPK1 kinase activity also prevented Ripk1D325A/D325A embryonic lethality, although the mice died before weaning from multi-organ inflammation in a RIPK3-dependent manner. Consistently, Ripk1D325A/D325A and Ripk1D325A/ cells were hypersensitive to RIPK3-dependent TNF-induced apoptosis and necroptosis. Heterozygous Ripk1D325A/ mice were viable and grossly normal, but were hyper-responsive to inflammatory stimuli in vivo. Our results demonstrate the importance of caspase-mediated RIPK1 cleavage during embryonic development and show that caspase cleavage of RIPK1 not only inhibits necroptosis but also maintains inflammatory homeostasis throughout life.

Data availability

The original RNA sequencing data are uploaded and available at the Gene Expression Omnibus (GEO) under accession GSE127572. All other data are available from the corresponding authors upon reasonable request.


  1. 1.

    Bertrand, M. J. M. et al. cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol. Cell 30, 689–700 (2008).

  2. 2.

    Dondelinger, Y. et al. MK2 phosphorylation of RIPK1 regulates TNF-mediated cell death. Nat. Cell Biol. 19, 1237–1247 (2017).

  3. 3.

    Dondelinger, Y. et al. NF-κB-independent role of IKKα/IKKβ in preventing RIPK1 kinase-dependent apoptotic and necroptotic cell death during TNF signaling. Mol. Cell 60, 63–76 (2015).

  4. 4.

    Jaco, I. et al. MK2 phosphorylates RIPK1 to prevent TNF-induced cell death. Mol. Cell 66, 698–710.e5 (2017).

  5. 5.

    Feltham, R. et al. Mind bomb regulates cell death during TNF signaling by suppressing RIPK1’s cytotoxic potential. Cell Reports 23, 470–484 (2018).

  6. 6.

    Menon, M. B. et al. p38MAPK/MK2-dependent phosphorylation controls cytotoxic RIPK1 signalling in inflammation and infection. Nat. Cell Biol. 19, 1248–1259 (2017).

  7. 7.

    Lafont, E. et al. TBK1 and IKKε prevent TNF-induced cell death by RIPK1 phosphorylation. Nat. Cell Biol. 20, 1389–1399 (2018).

  8. 8.

    Oberst, A. et al. Catalytic activity of the caspase-8–FLIPL complex inhibits RIPK3-dependent necrosis. Nature 471, 363–367 (2011).

  9. 9.

    Kim, J. W., Choi, E. J. & Joe, C. O. Activation of death-inducing signaling complex (DISC) by pro-apoptotic C-terminal fragment of RIP. Oncogene 19, 4491–4499 (2000).

  10. 10.

    Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y. & Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514–2526 (1999).

  11. 11.

    van Raam, B. J., Ehrnhoefer, D. E., Hayden, M. R. & Salvesen, G. S. Intrinsic cleavage of receptor-interacting protein kinase-1 by caspase-6. Cell Death Differ. 20, 86–96 (2013).

  12. 12.

    Dillon, C. P. et al. RIPK1 blocks early postnatal lethality mediated by caspase-8 and RIPK3. Cell 157, 1189–1202 (2014).

  13. 13.

    Kaiser, W. J. et al. RIP1 suppresses innate immune necrotic as well as apoptotic cell death during mammalian parturition. Proc. Natl Acad. Sci. USA 111, 7753–7758 (2014).

  14. 14.

    Kelliher, M. A. et al. The death domain kinase RIP mediates the TNF-induced NF-κB signal. Immunity 8, 297–303 (1998).

  15. 15.

    Rickard, J. A. et al. RIPK1 regulates RIPK3-MLKL-driven systemic inflammation and emergency hematopoiesis. Cell 157, 1175–1188 (2014).

  16. 16.

    Moulin, M. et al. IAPs limit activation of RIP kinases by TNF receptor 1 during development. EMBO J. 31, 1679–1691 (2012).

  17. 17.

    Peltzer, N. et al. LUBAC is essential for embryogenesis by preventing cell death and enabling haematopoiesis. Nature 557, 112–117 (2018).

  18. 18.

    Peltzer, N. et al. HOIP deficiency causes embryonic lethality by aberrant TNFR1-mediated endothelial cell death. Cell Reports 9, 153–165 (2014).

  19. 19.

    Varfolomeev, E. E. et al. Targeted disruption of the mouse Caspase 8 gene ablates cell death induction by the TNF receptors, Fas/Apo1, and DR3 and is lethal prenatally. Immunity 9, 267–276 (1998).

  20. 20.

    Yeh, W. C. et al. FADD: essential for embryo development and signaling from some, but not all, inducers of apoptosis. Science 279, 1954–1958 (1998).

  21. 21.

    Yeh, W. C. et al. Requirement for Casper (c-FLIP) in regulation of death receptor-induced apoptosis and embryonic development. Immunity 12, 633–642 (2000).

  22. 22.

    Kaiser, W. J. et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature 471, 368–372 (2011).

  23. 23.

    Alvarez-Diaz, S. et al. The pseudokinase MLKL and the kinase RIPK3 have distinct roles in autoimmune disease caused by loss of death-receptor-induced apoptosis. Immunity 45, 513–526 (2016).

  24. 24.

    Zhang, X., Dowling, J. P. & Zhang, J. RIPK1 can mediate apoptosis in addition to necroptosis during embryonic development. Cell Death Dis. 10, 245 (2019).

  25. 25.

    Dondelinger, Y. et al. Serine 25 phosphorylation inhibits RIPK1 kinase-dependent cell death in models of infection and inflammation. Nat. Commun. 10, 1729 (2019).

  26. 26.

    Geng, J. et al. Regulation of RIPK1 activation by TAK1-mediated phosphorylation dictates apoptosis and necroptosis. Nat. Commun. 8, 359 (2017).

  27. 27.

    Stennicke, H. R. & Salvesen, G. S. Catalytic properties of the caspases. Cell Death Differ. 6, 1054–1059 (1999).

  28. 28.

    Wong, W. W. et al. RIPK1 is not essential for TNFR1-induced activation of NF-κB. Cell Death Differ. 17, 482–487 (2010).

  29. 29.

    Newton, K. et al. RIPK1 inhibits ZBP1-driven necroptosis during development. Nature 540, 129–133 (2016).

  30. 30.

    Cuchet-Lourenço, D. et al. Biallelic RIPK1 mutations in humans cause severe immunodeficiency, arthritis, and intestinal inflammation. Science 361, 810–813 (2018).

  31. 31.

    Micheau, O., Lens, S., Gaide, O., Alevizopoulos, K. & Tschopp, J. NF-kappaB signals induce the expression of c-FLIP. Mol. Cell. Biol. 21, 5299–5305 (2001).

  32. 32.

    Croft, S. N., Walker, E. J. & Ghildyal, R. Human Rhinovirus 3C protease cleaves RIPK1, concurrent with caspase 8 activation. Sci. Rep. 8, 1569 (2018).

  33. 33.

    Pearson, J. S. et al. EspL is a bacterial cysteine protease effector that cleaves RHIM proteins to block necroptosis and inflammation. Nat. Microbiol. 2, 16258 (2017).

  34. 34.

    Kim, D., Langmead, B. & Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat. Methods 12, 357–360 (2015).

  35. 35.

    Anders, S., Pyl, P. T. & Huber, W. HTSeq—a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics 31, 166–169 (2015).

  36. 36.

    Huang, W., Sherman, B. T. & Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat. Protocols 4, 44–57 (2009).

  37. 37.

    Sun, J., Nishiyama, T., Shimizu, K. & Kadota, K. TCC: an R package for comparing tag count data with robust normalization strategies. BMC Bioinformatics 14, 219 (2013).

  38. 38.

    Robinson, M. D., McCarthy, D. J. & Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139–140 (2010).

  39. 39.

    Newton, K., Sun, X. & Dixit, V. M. Kinase RIP3 is dispensable for normal NF-κBs, signaling by the B-cell and T-cell receptors, tumor necrosis factor receptor 1, and Toll-like receptors 2 and 4. Mol. Cell. Biol. 24, 1464–1469 (2004).

  40. 40.

    Murphy, J. M. et al. The pseudokinase MLKL mediates necroptosis via a molecular switch mechanism. Immunity 39, 443–453 (2013).

  41. 41.

    Conos, S. A., Lawlor, K. E., Vaux, D. L., Vince, J. E. & Lindqvist, L. M. Cell death is not essential for caspase-1-mediated interleukin-1β activation and secretion. Cell Death Differ. 23, 1827–1838 (2016).

  42. 42.

    Mandal, P. et al. RIP3 induces apoptosis independent of pronecrotic kinase activity. Mol. Cell 56, 481–495 (2014).

  43. 43.

    Newton, K. et al. Activity of protein kinase RIPK3 determines whether cells die by necroptosis or apoptosis. Science 343, 1357–1360 (2014).

Download references


This study was funded by the Intramural Research Programs of the National Human Genome Research Institute, the Intramural Research Program of NIH, NIH Clinical Center, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute, by European Research Council Advanced Grant 787826, by NHMRC grants 1025594, 1046984, 1145788, 1162765 and 1163581, NHMRC fellowships 1081421 and 1107149, by the Stafford Fox Foundation and was made possible through Victorian State Government Operational Infrastructure Support, Australian Government NHMRC IRIISS (9000433) and Australian Cancer Research Fund. N.L. is supported by project grant 1145588 from the Cancer Australia and Cure Cancer Australia Foundation and a Victorian Cancer Agency Mid-career Fellowship 17030. This work used the sequencing resources at the NIH Intramural Sequencing Center and the computational resources of the Biowulf Linux cluster at NIH ( We thank the families for their participation, D. Follmann for statistical advice, T. Uldrick and D. Fajgenbaum for assistance procuring samples, and D. Adams, A. Negro, A. Walts and Y. Yang for clinical and technical assistance, C. Liegeois for IT assistance and the staff of the WEHI Bioservices facility for mouse husbandry. The generation of Ripk1D325A and Ripk1D138N,D325A mice used in this study was supported by the Australian Phenomics Network (APN) and the Australian Government through the National Collaborative Research Infrastructure Strategy (NCRIS) program.

Author information

Author notes

  1. These authors contributed equally: Najoua Lalaoui, Steven E. Boyden, Hirotsugu Oda

  2. These authors jointly supervised this work: Daniel L. Kastner, John Silke


  1. The Walter and Eliza Hall Institute, Parkville, Victoria, Australia

    • Najoua Lalaoui
    • , Diep Chau
    • , Lin Liu
    • , Tobias Kratina
    • , Nima Etemadi
    • , Kristy Shield-Artin
    • , Christine Biben
    • , Holly Anderton
    • , Natasha Silke
    • , Andrew J. Kueh
    • , Marco J. Herold
    • , Cathrine Hall
    • , Mark McKenzie
    • , Amanda Light
    • , Edwin D. Hawkins
    • , Seth L. Masters
    • , Anne K. Voss
    •  & John Silke
  2. Department of Medical Biology, University of Melbourne, Parkville, Victoria, Australia

    • Najoua Lalaoui
    • , Lin Liu
    • , Nima Etemadi
    • , Kristy Shield-Artin
    • , Christine Biben
    • , Holly Anderton
    • , Andrew J. Kueh
    • , Marco J. Herold
    • , Mark McKenzie
    • , Edwin D. Hawkins
    • , Seth L. Masters
    • , Anne K. Voss
    •  & John Silke
  3. Inflammatory Disease Section, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Steven E. Boyden
    • , Hirotsugu Oda
    • , Geryl M. Wood
    • , Deborah L. Stone
    • , Monique Stoffels
    • , Patrycja M. Hoffmann
    • , Natalia Sampaio Moura
    • , David B. Beck
    • , Amanda K. Ombrello
    • , Gineth P. Pinto-Patarroyo
    • , Hongying Wang
    • , Jae Jin Chae
    • , Beverly K. Barham
    • , Anne Jones
    • , Tina M. Romeo
    • , Qing Zhou
    • , Ivona Aksentijevich
    •  & Daniel L. Kastner
  4. Centre for Innate Immunity and Infectious Diseases, Hudson Institute of Medical Research, Clayton, Victoria, Australia

    • Kate E. Lawlor
  5. Department of Molecular and Translational Science, Monash University, Clayton, Victoria, Australia

    • Kate E. Lawlor
  6. Light Imaging Section, Office of Science and Technology, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Kristien J. M. Zaal
  7. Translational Immunology Section, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Wanxia Li Tsai
    • , Mary D. Blake
    •  & Massimo Gadina
  8. Department of Laboratory Medicine, Clinical Center, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Hye Sun Kuehn
    •  & Sergio D. Rosenzweig
  9. Translational Vascular Medicine Branch, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Dan Yang
    • , Natalia I. Dmitrieva
    •  & Manfred Boehm
  10. Institute for Genetics & Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging-Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, Cologne, Germany

    • Laurens Wachsmuth
    •  & Manolis Pasparakis
  11. Center for Molecular Medicine (CMMC), University of Cologne, Cologne, Germany

    • Laurens Wachsmuth
    •  & Manolis Pasparakis
  12. Molecular Development of the Immune System Section, Laboratory of Immune System Biology; Clinical Genomics Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Lixin Zheng
    •  & Michael J. Lenardo
  13. Laboratory of Muscle Stem Cells and Gene Regulation, National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • Gustavo Gutierrez-Cruz
  14. NIH Intramural Sequencing Center, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA

    • James C. Mullikin
  15. Division of Rheumatology, Department of Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA

    • Andrew J. Gross
  16. Division of Pulmonary and Critical Care, Department of Medicine, University of California San Francisco, San Francisco, CA, USA

    • Anthony K. Shum


  1. Search for Najoua Lalaoui in:

  2. Search for Steven E. Boyden in:

  3. Search for Hirotsugu Oda in:

  4. Search for Geryl M. Wood in:

  5. Search for Deborah L. Stone in:

  6. Search for Diep Chau in:

  7. Search for Lin Liu in:

  8. Search for Monique Stoffels in:

  9. Search for Tobias Kratina in:

  10. Search for Kate E. Lawlor in:

  11. Search for Kristien J. M. Zaal in:

  12. Search for Patrycja M. Hoffmann in:

  13. Search for Nima Etemadi in:

  14. Search for Kristy Shield-Artin in:

  15. Search for Christine Biben in:

  16. Search for Wanxia Li Tsai in:

  17. Search for Mary D. Blake in:

  18. Search for Hye Sun Kuehn in:

  19. Search for Dan Yang in:

  20. Search for Holly Anderton in:

  21. Search for Natasha Silke in:

  22. Search for Laurens Wachsmuth in:

  23. Search for Lixin Zheng in:

  24. Search for Natalia Sampaio Moura in:

  25. Search for David B. Beck in:

  26. Search for Gustavo Gutierrez-Cruz in:

  27. Search for Amanda K. Ombrello in:

  28. Search for Gineth P. Pinto-Patarroyo in:

  29. Search for Andrew J. Kueh in:

  30. Search for Marco J. Herold in:

  31. Search for Cathrine Hall in:

  32. Search for Hongying Wang in:

  33. Search for Jae Jin Chae in:

  34. Search for Natalia I. Dmitrieva in:

  35. Search for Mark McKenzie in:

  36. Search for Amanda Light in:

  37. Search for Beverly K. Barham in:

  38. Search for Anne Jones in:

  39. Search for Tina M. Romeo in:

  40. Search for Qing Zhou in:

  41. Search for Ivona Aksentijevich in:

  42. Search for James C. Mullikin in:

  43. Search for Andrew J. Gross in:

  44. Search for Anthony K. Shum in:

  45. Search for Edwin D. Hawkins in:

  46. Search for Seth L. Masters in:

  47. Search for Michael J. Lenardo in:

  48. Search for Manfred Boehm in:


  49. Zoek naar Sergio D. Rosenzweig in:

  50. Zoek naar Manolis Pasparakis in:

  51. Zoek naar Anne K. Voss in:

  52. Zoek naar Massimo Gadina in:

  53. Zoek naar Daniel L. Kastner in:

  54. Zoek naar John Silke in:


NL, SEB en H.O. ontwierp en voerde experimenten en geïnterpreteerde gegevens uit. GMW, DC, LL, MS, TK, KEL, KJMZ, NE, KS-A., CB, WLT, MDB, HSK, DY, HA, NS, LW, LZ, NSM, DBB, GG-C., CH, HW, JJC, NID, MM, AL, QZ, IA, JCM, AKV en J.S. experimenten uitgevoerd. A.J.K., M.J.H., L.W. en M.P. genereerde de CRISPR-muizen. D.L.S., P.M.H., A.K.O., G.P.P.-P., B.K.B., A.J., T.M.R., A.J.G. en A.K.S. verstrekte de klinische gegevens. E.D.H., S.L.M., M.J.L., M.B., S.D.R. en M.G. bijgedragen reagentia, analyse en interpretatie. N.L., S.E.B., D.L.K. en J.S. het project bedacht en het artikel geschreven met input van alle auteurs.

Corresponderende auteurs

Correspondentie met                  Najoua Lalaoui a> of Steven E. Boyden of Daniel L. Kastner of John Silke .

Ethische verklaringen


Concurrerende belangen


De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.


Aanvullende informatie h2>

Noot van de uitgever Springer Nature blijft neutraal ten aanzien van claims van rechtbanken in gepubliceerde kaarten en institutionele connecties.

Uitgebreide gegevens en tabellen

Uitgebreide gegevens Afb. 1 Inflammatory gensignatuur in P7 volbloed-RNA.

a , MA-plot tussen twee P7-monsters en twee niet-gerelateerde gezonde adolescente controles, beide gesequenced met technische duplicaten. TCC-edgeR pakket van R gevolgd door aanpassing voor meerdere vergelijkingen gedetecteerd 1.394 differentieel tot expressie gebrachte genen (valse ontdekkingssnelheid b , termen van representatieve genontologie geassocieerd met immuunsignalering.

Verlengde gegevens Fig. 2 Exome leest in familie 1.

Fragmenten van dekkingshistogrammen en uitgelijnde exome-reeks leest voor de proband en haar ouders in familie 1, weergegeven met behulp van de integratieve genomics-viewer, demonstreren de novo het optreden van de c.970G> A (p.D324N) missense-mutatie in het LXXD caspase-6/8 splijtmotief voorafgaand aan de splijtplaats ( pijl). Vaderschap en moederschap werden bevestigd met behulp van Mendeliaanse overervingsfoutenpercentages van dezelfde exome-gegevens.

Uitgebreide gegevens Fig. 3 ‘Kinase-dead’ RIPK1 of gecombineerd verlies van Ripk3 en Casp8 redding Ripk1D325A/D325A letaliteit.

a , b , Waargenomen aantallen nakomelingen van Ripk1 D325A / kruisingen en aantallen verwacht van Mendeliaanse ratio’s in de aangegeven ontwikkelingsfase. Ripk1D325A/D325A muizen zijn E10.5. Alle waargenomen E11.5 Ripk1D325A/D325A embryo’s waren dood en de meeste E10.5 Ripk1 D325A / D325A embryo’s waren abnormaal, zoals beschreven in Fig. 2a, b . Verlies van Ripk3 gered naar E12.5; 50% van de embryo’s was echter abnormaal. Geen van de Ripk1D325A/D325ARipk3 – / – muizen werden geboren. Alle waargenomen E11.5 Ripk1D325A/D325AMlkl – / – embryo’s waren dood, waaruit bleek dat het verlies van Mlkl geen enkele bescherming bood. Alle Ripk1D325A/D325ARipk3 – / – sup > Casp8 – / – muizen werden geboren en ontwikkelden ALPS vanwege het verlies van Casp8 . c , Kaplan – Meyer overlevingscurven van de aangegeven genotypen. d , cervicale lymfeklieren (LN), milt en thymus van 17 weken oude muizen met de aangegeven genotypen. Afbeeldingen zijn representatief voor vijf muizen per genotype. e , Weefselsecties van 18 dagen oud Ripk1 D138N, D325A / , Ripk1 D138N, D325A / D138N, D325A en controlemuizen gekleurd met H&E (links) en anti-CC3 (bruin; rechts). Afbeeldingen zijn representatief voor twee muizen per genotype.

Uitgebreide gegevens Fig. 4 Ripk1 D325A / cellen zijn overgevoelig voor door TNF geïnduceerde dood.

a c , MDF’s ( a ), BMDM’s ( b ) en MEF’s ( c ) van de aangegeven genotypen werden behandeld met ofwel een hoge dosis TNF (T100; 100 ng ml -1 ) of een lage dosis TNF (T ; 10 ng ml -1 ) gecombineerd met SMAC-mimeticum (S; 100 nM), caspaseremmer (I; 5 µM), RIPK3-remmer (R; 1 µM), necrostatin (N; 10 µM) , TAK1-remmer (TAKi; 100 nM), IKK-remmer (I KKi; 100 nM), MK2-remmer (MK2i; 2 µM) of cycloheximide (1 µg ml -1 ) gedurende 16 uur. Celdood werd gekwantificeerd door propidiumjodide-opname en time-lapse-beeldvorming elke 30-45 minuten met behulp van IncuCyte. Duplicaten worden getoond voor elk genotype. Grafieken zijn representatief voor drie (MEF’s en MDF’s) en twee (BMDM’s) biologisch onafhankelijke cellijnen per genotype dat onafhankelijk wordt herhaald. d , MEF’s werden behandeld zoals in Fig. 3d gedurende 2 uur. e , f , MDF’s ( e ) en MEF’s ( f ) werden behandeld zoals in Fig. 3d voor de aangegeven tijden. Resultaten in d f zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. P-Actine werd gebruikt als een laadcontrole. g , BMDM’s werden behandeld met TNF (100 ng ml -1 ) gecombineerd met SMAC mimetic (500 nM) met of zonder caspaseremmer (5 µM) gedurende 90 minuten, en lysaten werden immuun-neergeslagen met anti-FADD. Resultaten zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. Voor aanvullende brongegevens, zie aanvullende afbeelding. 2 .

Uitgebreide gegevens Fig. 5 Alternatieve splitsing van RIPK1.

a , MEF’s werden 2 uur behandeld met 10 ng ml -1 TNF gecombineerd met 500 nM SMAC mimeticum. b , Doxycycline-induceerbare caspase-8-gyrase 41 , RIPK1-constructen van wildtype en mutante muizen of GFP werden tot expressie gebracht in 293T-cellen. Cellen werden 2 uur behandeld met 1 μg ml -1 doscycline om caspase-8-gyrase-expressie te induceren en vervolgens 2 uur met 700 nM coumermycine om caspase-8-gyrase te dimeriseren. Antilichaam dat het N-terminale uiteinde van RIPK1 herkent, werd gebruikt. Resultaten zijn representatief voor vier ( a ) en twee ( b ) onafhankelijke experimenten. Voor aanvullende brongegevens, zie aanvullende afbeelding. 2 .

Uitgebreide gegevens Afb. 6 RIPK1-splitsing beperkt ontsteking op een NF-KB-onafhankelijke manier.

a , serum-cytokineniveaus bij wildtype en Ripk1 D325A / muizen die gedurende 3 uur met 50 μg werden behandeld van poly (I: C). Elke stip vertegenwoordigt een muis. Gegevens zijn gemiddelde ± s.e.m., n = 3 muizen. b , TNF-niveaus in de supernatant (S / N) van twee niet-gerelateerde adolescente controles (Ctl RIPK1 / ) en P7 RIPK1 D324Y / PBMC’s behandeld gedurende 3 uur met 5 µg ml −1 poly (I: C). Gegevens zijn gemiddelde van triplicaten. c , lichaamstemperatuur van muizen van de aangegeven genotypen na injectie van 2 mg kg -1 LPS. Elke lijn vertegenwoordigt een muis; n = 5 muizen per genotype. d , BMDM’s van de aangegeven genotypen werden 24 uur behandeld met 25 ng ml -1 LPS of met 2,5 μg ml −1 poly (I : C). Celdood werd gekwantificeerd door propidiumjodidekleuring en flowcytometrie. Elke stip vertegenwoordigt een biologische herhaling. Grafiek toont gemiddelde; n = 1 voor Ripk1 / en n = 2 voor Ripk1 D325A i> / sup>. e , f , BMDM’s ( e ) en MDF’s ( f ) werden behandeld met 100 ng ml −1 van TNF voor de aangegeven tijden. Resultaten zijn representatief voor twee onafhankelijke experimenten. P-Actine werd gebruikt als een laadcontrole. Voor aanvullende brongegevens, zie aanvullende afbeelding. 2 . g , NF-KB-activering in fibroblasten afgeleid van huidbiopten van patiënten werd beoordeeld door het meten van nucleaire translocatie van subeenheid p65. Elke stip vertegenwoordigt de mediaan van meer dan 1.000 eencellige metingen van nucleaire gemiddelde p65 fluorescentie-intensiteiten voor één individu. Gegevens zijn gemiddelde ± s.d., n = 4 patiënten en 4 controles. P waarden bepaald door niet-gepaarde eenzijdige ( a ) of ongepaarde tweezijdige ( g ) t -tests .

Uitgebreide gegevens Fig. 7 Voorgesteld model voor door RIPK1 (D325A) geïnduceerde celdood.

Links, TNF-binding aan TNFR1 veroorzaakt de vorming van complex I, en daaropvolgende ubiquitylatie en fosforylering van RIPK1 . Deze post-translationele modificaties (PTM’s) remmen de cytotoxische activiteit van RIPK1. Complex I-vorming activeert NF-KB- en MAPK-afhankelijke overlevingsgenen zoals CFLAR , die coderen voor cFLIP. Vervolgens wordt een cytosolcomplex II met FADD, caspase-8, RIPK1 en cFLIP gevormd. In dit complex remt cFLIP de activiteit van caspase-8 zodat een beperkt aantal substraten (zoals RIPK1) wordt gesplitst, maar andere (zoals pro-caspase-3) niet. Splitsing van RIPK1 ontmantelt complex II. Activering van de NF-KB en MAPK-signaleringsroutes PTM van RIPK1 voorkomen dat TNF celdood induceert, resulterend in celoverleving (linksboven). Remming van de NF-KB of MAPK-signaleringsroutes vermindert niveaus van cFLIP en versnelt de vorming van complex II, resulterend in celdood via apoptose (midden links). Wanneer NF-KB of MAPK-signalering wordt verstoord in caspase-8-deficiënte omstandigheden, wordt RIPK1 niet gesplitst en autofosforyleert, wat de aanwerving van RIPK3 en zijn autofosforylering in gang zet. RIPK3 fosforyleert MLKL en necroptose treedt op (linksonder). Volgens dit model kan een gebrek aan RIPK1-splitsing als volgt resulteren in verschillende resultaten. (1) RIPK1-accumulatie zou complex II kunnen stabiliseren, en de aanwezigheid van cFLIP en remmende PTM’s voor RIPK1 kan voorkomen dat caspase-8 wordt gedood, wat resulteert in celoverleving. (2) De accumulatie van ‘niet-splitsbaar’ RIPK1 tot complex II kan de remmende RIPK1 PTM’s teniet doen, wat leidt tot autofosforylering van RIPK1 en rekrutering van RIPK3, wat leidt tot necroptose. (3) RIPK1-accumulatie kan resulteren in geactiveerd caspase-8 dat RIPK3 splitst, resulterend in celoverleving. (4) Stabilisatie van complex II kan leiden tot rekrutering en activering van caspase-8 die apoptose induceert en mogelijk necroptose voorkomt door RIPK3 te splitsen. (5) Ten slotte zou de accumulatie van RIPK1 kunnen resulteren in activering van zowel RIPK3 als caspase-8 en derhalve zowel apoptotische als necroptotische celdood induceren. In termen van hoe deze potentiële resultaten overeenkomen met onze gegevens, in homozygote Ripk1D325A cellen, worden zowel caspase-8 en RIPK3 geactiveerd na TNF-signalering , wat suggereert dat apoptose en necroptose tegelijkertijd optreden (Fig. 2d , 3a, b ). Volgens deze modellen beperkt het verlies van RIPK3 echter de activering van caspase-8 (Fig. 3a, b ). Dit suggereert dat de werving van RIPK3 tot complex II de werving en activering van caspase-8 verhoogt. Een precedent voor deze observatie komt van experimenten waarin RIPK3-remmers de RIPK1-afhankelijke activering van caspase-8 hebben bevorderd 42 , 43 , op een manier die we ‘omgekeerde activering’ noemen. In onze experimenten vindt RIPK3-activering echter stroomafwaarts van TNF-signalering plaats, wat suggereert dat reverse activering een fysiologische amplificatielus kan zijn die activering van caspase-8 verhoogt. Deze vereiste voor RIPK3 is echter niet in alle cellen aanwezig, omdat de embryonale letaliteit van de RIPK1-splitsingsmutant slechts gedeeltelijk wordt gered door verlies van Ripk3 . In de heterozygoot Ripk1D325A cellen splitst caspase-8 wildtype RIPK1, waardoor aldus door TNF geïnduceerde celdood wordt beperkt in vergelijking met homozygote cellen. Vermindering van cFLIP- en / of RIPK1-PTM’s door behandeling met IAP, TAK1, IKK of translationele remmers verlaagt echter de drempel van TNF-gevoeligheid (uitgebreide gegevens Fig. 4 ). Dit kan de hyper-inflammatoire respons veroorzaken die wordt waargenomen bij patiënten met CRIA-syndroom (Fig. 1 ).

Extended Datatabel 1 Leukocyten-oppervlaktemarkers bij patiënten met CRIA-syndroom

Uitgebreide datatabel 2 Effect van tocilizumab-behandeling en RIPK1 caspase-splitsingsplaatsmutaties zijn afwezig bij bekende auto-inflammatoire ziekten

Uitgebreide gegevenstabel 3 Behoud van RIPK1 caspase-8 decollete-site

Aanvullende informatie

Over dit artikel

Citeer dit artikel

Lalaoui, N., Boyden, SE , Oda, H. et al. Mutaties die caspase-splitsing van RIPK1 voorkomen, veroorzaken auto-inflammatoire ziekte.                      Nature (2019) doi: 10.1038 / s41586-019-1828-5

Citatie downloaden

  • ontvangen

  • Geaccepteerd

  • gepubliceerd h4>

  • DOI

    li > ul> div> div> div> div> section>                                                                               


    Door een reactie in te dienen gaat u ermee akkoord door onze voorwaarden en Communityrichtlijnen . Als u iets verkeerds vindt of dat niet voldoet aan onze voorwaarden of richtlijnen, markeer het dan als ongepast.

    Lees Meer